RP－HPLC法測定核桃外果皮中齊墩果酸的含量

張瑞廷 徐 佳 傅 力

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

RP－HPLC法測定核桃外果皮中齊墩果酸的含量

張瑞廷 徐 佳 傅 力

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

建立核桃外果皮中齊墩果酸含量測定的反相高效液相色譜法（RP－HPLC），采用色譜柱為Intersil ODS（150mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇∶水∶冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）；流速0.8mL/min；進樣量20μL；檢測波長為210nm；柱溫30℃。結果表明，齊墩果酸進樣量在0.728～7.28μg（r＝0.999 7）范圍內呈現良好的線性關系，齊墩果酸平均回收率 （n＝9）為101.1%，相對標準偏差（RSD）為2.44%。測得核桃外果皮中齊墩果酸含量為2.1mg/100g。該方法簡便快速，結果可靠準確，重現性和穩定性好。

反相高效液相色譜法；核桃外果皮；齊墩果酸

核桃外果皮成分復雜，主要化學成分有胡桃醌、α－氫化胡桃醌－4－葡萄糖苷、鞣質、沒食子酸、胡桃醌生物堿及萘醌等。最新報道顯示核桃外果皮中存在齊墩果酸［1］，齊墩果酸（oleanolic acid，OA）是五環三萜類化合物，以游離體和配糖體的形式存在于多種植物中，具有保肝護肝、抗炎抗菌抗病毒、抗氧化、抗癌等藥理作用［2］，齊墩果酸的分析方法目前尚無國標方法，常用的檢測方法有薄層色譜法［3］、氣相色譜法［4］、液相色譜法等，其中以液相色譜分析方法居多，對于不同的檢測對象，采用液相色譜法檢測齊墩果酸的條件均有所不同［5－7］，采用液相色譜法分析核桃外果皮中齊墩果酸尚未見報道。本試驗在前人研究［8－10］的基礎上，通過對檢測條件的優化，建立核桃外果皮中齊墩果酸的液相色譜分析方法。齊墩果酸較易溶于氯仿、甲醇、丙酮、乙醇等，但不溶于水和石油醚。本試驗在樣品制備過程中，先用乙醇進行提取，再用石油醚萃取出極性較小的成分，最后用氯仿萃取齊墩果酸。通過不同極性溶劑的分級萃取，以保證核桃外果皮中齊墩果酸的提取效果，同時降低在分析過程中其他成分對齊墩果酸的干擾。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

齊墩果酸標準品：美國Sigma公司；

甲醇：色譜純，美國天地公司；

高效液相色譜儀（配SPD－20A紫外檢測器，LC solution色譜工作站）：島津LC－20AB，日本Shimadzu公司；

紫外可見光分光光度計：TU－1810，北京普析通用儀器有限責任公司；

梅特勒分析天平：XS205，梅特勒－托利多上海有限公司；

循環水式多用真空泵：SHB－Ⅲ，鄭州長城科工貿有限公司；

旋轉蒸發器：RE－85C，上海青浦滬西儀器廠；

旋渦混合器：XH－C，常州市國立試驗設備研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 齊墩果酸標準儲備液配制 稱取齊墩果酸標準品9.1mg，用甲醇定容至25mL，搖勻，即得0.396mg/mL的齊墩果酸標準溶液，于4℃保存。

1.2.2 樣品溶液制備 將陰干的核桃外果皮粉碎后過40目篩，得到核桃外果皮粗粉。取50g粗粉加入500mL 95%乙醇浸提，過濾后減壓濃縮，得到乙醇浸膏2.25g，將乙醇浸膏用適量蒸餾水分散，依次用石油醚、氯仿萃取，減壓濃縮各萃取溶液，得到不同萃取部位浸膏。稱取氯仿萃取部位浸膏0.016 0g加入1mL甲醇，渦旋振蕩使其充分溶解，微孔濾膜（0.45μm）過濾，濾液供進樣。

1.2.3 HPLC分析條件 色譜柱為Intersil ODS（150mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇∶水∶冰乙酸 （265∶35∶0.1，V/V）；流速0.8mL/min；檢測波長210nm；柱溫30℃；進樣量20μL。

1.2.4 檢測波長的選擇 齊墩果酸標準品在紫外可見光分光光度計上進行吸收光譜掃描，掃描波長范圍190～600nm，得到幾個最大吸收波長。在此基礎上利用液相色譜在1.2.5中4種不同的流動相，通過比較幾個最大吸收波長范圍下的色譜圖篩選出最佳波長。

1.2.5 流動相的選擇 比較甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）、甲醇－水－三乙胺（85∶15∶0.06，V/V）、乙腈－甲醇－水－乙酸銨（69∶16∶15∶1，V/V）、以及甲醇－0.1mol/L NaH2PO4（85.2∶14.8，V/V）4種流動相條件下核桃外果皮中齊墩果酸的分離效果及峰形對稱性。

1.2.6 線性關系考察 吸取齊墩果酸標準品溶液（0.396mg/mL）2，4，8，10，15，20μL，分別進樣3次，以色譜峰面積（Y）為縱坐標，標準品進樣量（X）為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.7 精密度試驗 吸取齊墩果酸標準品溶液（0.396mg/mL），進樣20μL，連續6次，測定齊墩果酸的含量，計算RSD值。

1.2.8 穩定性試驗 取1.2.2制備的樣品溶液，分別在0，2，4，6，8h進樣20μL測定齊墩果酸含量，計算RSD值。

1.2.9 重復性試驗 取 1.2.2制備的樣品溶液，進樣20μL，重復進樣6次，測定齊墩果酸的含量，計算RSD值。

1.2.10 加標回收率試驗 在已知齊墩果酸含量的核桃外果皮中分別加入14.56，29.12，58.24μg齊墩果酸標準品，按1.2.2方法制備樣品溶液，微孔濾膜（0.45μm）過濾，按1.2.3色譜條件進樣20μL測定峰面積，計算加標回收率。

1.2.11 核桃外果皮中齊墩果酸含量測定 稱取按1.2.2制備得到的核桃外果皮氯仿萃取部位浸膏0.016 0g，加入1mL甲醇，渦旋使其充分溶解，微孔濾膜（0.45μm）過濾，進樣20μL分析，重復測定3次，經外標法定量，計算齊墩果酸的含量。

2 結果與討論

2.1 齊墩果酸標準品溶液的紫外吸收掃描

由圖1可知，在紫外分光光度計上對齊墩果酸標準品溶液進行掃描，發現在208，209，213，214nm 4個波長處均有吸收峰，見圖1。

圖1 齊墩果酸標準品吸收光譜圖Figure 1 Absorption spectrum of oleanolic acid standard sample

2.2 檢測波長的選擇

依據齊墩果酸標準品的紫外掃描結果，在1.2.5中4種不同流動相條件下，通過比較208～214nm下的色譜圖，發現波長為210nm，流動相為甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.01，V/V）時，基線相對平整，分離效果較好，齊墩果酸峰形對稱（見圖2），故最終選擇210nm為檢測波長。

圖2 標準品的HPLC色譜圖Figure 2 HPLC chromatograms of standard sample

2.3 流動相的選擇

當采用乙腈－甲醇－水－乙酸銨（69∶16∶15∶1，V/V）以及甲醇－0.1mol/L NaH2PO4（85.2∶14.8，V/V）為流動相時，齊墩果酸與核桃外果皮中其他成分的色譜峰出現疊加，分離效果不甚理想。當采用甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）和甲醇－水－三乙胺（85∶15∶0.06，V/V）為流動相時齊墩果酸的分離效果較好，且峰形比較對稱。加入少量三乙胺雖然有利于改變峰形［11］，提高分離度，但是三乙胺對ODS柱的損害較大。因此選擇甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）為流動相，能夠較好的分離齊墩果酸（如圖2所示）。同時該流動相的弱酸性環境有利于改變峰形。由于齊墩果酸在酸堿條件下均不穩定，所以冰乙酸的添加量應控制流動相的pH值保持在6.5。

2.4 標準曲線的繪制

齊墩果酸標準品的色譜圖見圖2，得到回歸方程為：Y＝1.087 59×106X＋74 605.9（r＝0.999 7），齊墩果酸進樣量在0.728～7.28μg范圍內呈現良好的線性關系，齊墩果酸的保留時間約為10min，齊墩果酸和相近的其他峰分離完全（分離度＞1.5）。

2.5 精密度試驗

由表1可知，相對標準偏差RSD（n＝6）為1.89%，表明精密度良好，能夠滿足試驗要求。

表1 精密度試驗結果Table 1 Result of precision test（n＝6）

2.6 穩定性試驗

由表2可知，齊墩果酸在0，2，4，6，8h含量穩定，相對標準偏差（RSD）為2.34%（n＝5）。

表2 穩定性試驗結果Table 2 Result of stability test（n＝5）

2.7 重復性試驗

由表3可知，相對標準偏差（RSD）為1.96%（n＝6），顯示重復性良好。

表3 重復性試驗Table 3 Result of repeating test（n＝6）

2.8 加標回收率試驗

由表4可知，齊墩果酸平均加標回收率為101.1%，相對標準偏差（RSD）為2.44%（n＝9），表明加標回收率較好。

2.9 核桃外果皮中齊墩果酸含量測定

由圖3可知，核桃外果皮中齊墩果酸與其他成分分離較好，且目標峰峰形對稱，經外標法定量，計算得出核桃外果皮中齊墩果酸含量為2.1mg/100g。

表4 齊墩果酸加標回收率結果Table 4 Recovery experiment of oleanolic acid（n＝9）

圖3 核桃外果皮的HPLC色譜圖Figure 3 HPLC chromatograms of walnut pericarp

3 結論

（1）本試驗在繪制標準曲線過程中，沒有按傳統配制一系列濃度的標準品溶液，而是通過改變進樣量的體積來改變標準品的濃度，提高了試驗的精度，減少了在配制標準品溶液過程中可能出現的誤差。

（2）本試驗采用反相高效液相色譜法對核桃外果皮氯仿萃取部位中的齊墩果酸進行定性定量分析，檢測出齊墩果酸的含量較高，達到了2.11%，因此從核桃外果皮中提取分離齊墩果酸具有實際意義，能夠增加核桃外果皮新的利用途徑及經濟附加值。

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Determination of oleanolic acid in walnut pericarp by RP－HPLC

ZHANG Rui－ting XU JiaFU Li

（College of Food Science and Pharmaceutical Science，Xinjiang Agricultural University，Xinjiang，Urumqi830052，China）

The method was established for the determination of oleanolic acid in walnut pericarp by RP－HPLC，with the chromatographic column of intersil ODS（150mm×4.6m，5μm），the mobile phase consisted of methanol∶water∶acetic acid（265∶35∶0.1，V/V）at the flow rate of 0.8mL/min；the injection volume was 20μL；the detection wavelength was 210nm and the column temperature was 30℃.The results showed that the good linear range of oleanolic acid was 0.728～7.28μg（r＝0.999 7），and the average recovery（n＝9）rate was 101.1%with RSD of 2.44%.The content of oleanolic acid in walnut pericarp was 2.1mg/100g.This method is simple and quick.The result is accurate and repeatable.

RP－HPLC；walnut pericarp；oleanolic acid

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.03.023

國家“十一五”科技支撐計劃項目（編號：2007BAD36B04）；新疆維吾爾自治區高校科研計劃科學研究重點項目（編號：XJEDU2008I13）

張瑞廷（1982－）男，新疆農業大學在讀碩士研究生。E－mail：zrt00016203＠sina.com

傅力

2011－03－25