自黑鯛腸道分離一株發光細菌的種類鑒定及其發光特性的研究

毛芝娟，楊季芳，王晶，黃桔玨

（浙江萬里學院 生物與環境學院，浙江 寧波 315100）

自黑鯛腸道分離一株發光細菌的種類鑒定及其發光特性的研究

毛芝娟，楊季芳，王晶，黃桔玨

（浙江萬里學院 生物與環境學院，浙江 寧波 315100）

從浙江省象山港網箱養殖黑鯛（Sparus macrocephlus）腸道分離到一株發光細菌LB01，經過形態觀察、生理生化特性測試和16S rRNA基因序列分析，確定這株菌屬于鰒發光桿菌（Photobacteria leiognathi）。同時對這株菌的發光條件和發光特點進行了初步研究，結果表明，LB01在470 nm左右出現最大發射波長，在pH值 5.0～6.0，溫度20℃左右，NaCl濃度3%左右等條件下發光最強。

鰒發光桿菌；鑒定；發光特性

發光細菌是一類在正常的生理條件下能夠發射在黑暗處肉眼可見熒光的異養細菌[1]。目前，全世界已發現和命名的發光細菌有11種[2,3]，分別屬于異短桿菌屬（Xenorhabdus）、發光桿菌屬（Photobacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）和弧菌屬（Vibrio）。不同種類發光細菌的發光機理相同，由分子氧作用，胞內熒光酶催化，將還原態的黃素單核苷酸（FMNH2）及長鏈脂肪醛氧化為FMN 及長鏈脂肪酸，同時釋放出最大發光強度在波長為450～490 nm處的藍綠光。

發光細菌在一定的實驗條件下發光強度是恒定的，但與外來受試物接觸后，由于毒物具有抑制發光的作用，發光細菌的發光強度即有所改變，發光強度的變化可以用生物毒性發光測定儀測出。目前，發光細菌生物測試法已經在環境監測、食品安全檢測、醫學衛生等領域中得到廣泛應用[4-7]。發光細菌檢測有毒物質具有費時較少且敏感性較好、操作簡便、結果準確等優點。

本研究自象山港網箱養殖黑鯛（Sparus macrocephlus）腸道內分離到一株發光細菌，對這株菌進行了形態學觀察、生理生化特性測試和分子生物學鑒定，并對其生長條件及發光特性進行了初步研究，旨在為該菌在生物傳感器中可能的應用提供部分基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基的種類和配方 實驗中用到海水2216E培養基、發光固體培養基、發光液體培養基、LB（Luria-Bertani）培養基和TCBS培養基。

海水 2216E培養基配方如下：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，磷酸鐵0.01 g，加陳海水1 000 mL，調pH值 7.6，121℃，滅菌20 min。固體培養基則加入1.6 %的瓊脂粉。

發光固體培養基和發光液體培養基參照杜宗軍等[8]的配方。

LB培養基配方如下：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g（固體培養基加瓊脂粉 16 g），加蒸餾水1 000 mL，調pH值 7.2～7.4，121℃，滅菌20 min。

TCBS培養基采用杭州天和微生物試劑有限公司的成品培養基TCBS瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 發光菌株的分離 以無菌方法取出一健康黑鯛（重 150 g，取自浙江省象山港養殖網箱）的腸道內容物，以無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，取稀釋液涂布海水 2216E平板和發光固體平板，28℃，黑暗條件下培養，觀察發光菌落的出現情況。24 h后出現發光菌落，轉接，分離，得到穩定發光的菌株LB01。

1.2.2 發光菌株的形態和理化特性鑒定 對分離的發光細菌菌株進行形態和生理生化特征測定，測定方法參照文獻[9,10]，微量生化反應管購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2.3 發光菌株的16S rDNA序列的PCR及序列同源性分析 選用細菌通用16S rRNA引物[11]，序列為 p1：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’，p2：5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’，以發光細菌基因組DNA為模板，PCR反應程序為：94℃，初始變性 4 min，94℃，變性 30 s，55℃，退火 45 s，72℃，延伸90 s，進行30個循環后，72℃終延伸7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化回收，送交英濰捷基（上海）貿易有限公司測序，所得序列經BlastN比對后以MEGA 4.0采用鄰接法構建系統發育樹，進行同源性分析。

1.2.4 發光特性的檢測

1.2.4.1 發光菌株的發光波長、發光強度檢測檢測儀器為可見光熒光分光光度計（Hitachi F－4 500），檢測發光波長時，掃描波長范圍為350～600 nm，檢測相對發光強度 I（a.u）。

1.2.4.2 NaCl濃度對菌株發光的影響 配制濃度分別為 0、1%、2%、3%、5%、7.5%和 10%的NaC1緩沖液；挑 LB01單菌落接入 5 mL 海水2216E液體培養基中，30℃ 振蕩培養5 h，取 LB01菌培養液100 μL，加入到0.9 mL不同濃度的NaC1鹽水緩沖液中，測定發光強度。

1.2.4.3 PH 值對菌株發光的影響 取 100 μL LB01培養液接入0.9 mL pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0含3%NaC1的緩沖液中，測定發光強度。

1.2.4.4 培養時間對菌株發光的影響 取 LB01培養液100 μL轉接入25 mL海水2216E液體培養基，28℃恒溫，暗處培養 3～48 h，定期用肉眼觀察記錄發光情況。

1.2.4.5 溫度對菌株發光的影響 取 100 μL LB01培養液，加入到0.9 mL溫度分別為4℃、20℃、30℃、35℃、40℃的3%NaC1緩沖液中，測定發光強度。

1.2.4.6 細菌密度對發光的影響 取5、10、20、50、100、200 μL LB01 培養液，分別加入到 5 mL 3%的NaC1緩沖液中，測定發光強度和OD600值。

2 結 果

2.1 LB01的形態學和理化特性鑒定

通過2216E平板和發光平板培養觀察，自黑鯛腸道內容物中分離得到一株發光細菌，命名為LB01。該菌株在 2216E固體培養基上的菌落為圓形，乳白色，不透明，表面濕潤，邊緣整齊，黑暗處發出藍綠色熒光。在TCBS培養基上的菌落為綠色，呈擴散狀生長，不發光。革蘭氏染色陰性，菌體呈桿狀。

以微量生化管法對LB01菌株的主要理化特性進行了檢測，結果見表1。該菌4℃生長，對O/129（150 μg/mL）不敏感，發酵葡萄糖產酸不產氣，氧化酶、過氧化氫酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽降解陽性；不產生脂酶、淀粉酶和脂肪酶；生長需鈉；能發酵乙酸鹽、纖維二糖、半乳糖、甘露糖等碳水化合物作為單一碳源。除 4℃生長、賴氨酸脫羧反應陽性、8% NaCl胨水中生長、發酵利用纖維二糖等幾項外，與鰒發光桿菌（Photobacterium leiognathi）[12]的特性最為接近。對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）[9]，該菌株可以初步鑒定為發光桿屬中的鰒發光桿菌。

表1 菌株LB01的形態和理化特性Tab. 1 Morphological, physical and biochemical characteristics of strain LB01

2.2 LB01的分子生物學鑒定

采用細菌16S rDNA通過引物，以LB01基因組DNA為模板，進行PCR，獲得了特異性的目的片段，長約1 500 bp（圖1）。PCR產物直接測序后獲得1 419 bp的序列，BlastN比對結果表明，該序列與數種發光細菌包括鰒發光桿菌、P. kishitanii、明亮發光桿菌和P.iliopiscarium等相應序列的相似性均在99%以上，其中與鰒發光桿菌（基因登錄號：AY292947）16S rRNA基因序列100%同源。選取同源性最高的序列構建了系統發育圖（圖 2），圖中可以看出，LB01株16S r RNA基因與發光桿菌P.leiognathi聚為一類，與 P. kishitanii、P.phosphoreum等高度相似性序列（99%以上）則聚為一大類，而與P.iliopiscarium（AY849430）距離稍遠，成為兩個分枝。

結合理化特性鑒定的結果，LB01菌株可以鑒定為鰒發光桿菌。

圖1 LB01 16S rRNA基因的PCRFig. 1 PCR amplifying of 16S rRNA gene of strain LB01 1：LB01 16S rRNA基因的PCR產物； Marker：DNA 分子量標準

2.3 LB01的發光特性

對LB01菌株的發光特性展開了初步的研究，結果見表2－3和圖3－7。從圖中可以看出，LB01的最大發光波長在470 nm左右；在pH值6.0，溫度20℃，NaCl濃度為3.0%左右時，發光強度最高。LB01菌株正常發光的溫度范圍在15～25℃，pH值范圍在5.0～7.5，適應范圍較廣。該菌株在細胞密度達到一定值（如OD600值=0.09）后，發光強度迅速增強；液體培養4 h開始發光，培養7 h左右時，發光達到峰值，持續發光時間長，可達26 h。

圖2 LB01 16S rDNA序列的系統發育樹Fig. 2 Phylogenic tree of 16S rDNA of strain LB01

圖3 LB01菌株的掃描波長與相對發光強度Fig. 3 Scanning wavelength and the relative luminescence strength of strain LB01

圖4 PH值與LB01發光強度的關系Fig. 4 Effects on the luminescence of LB01 by the pH value

圖5 溫度與LB01發光強度的關系Fig. 5 Effects on the luminescence of LB01 by temperature

圖6 鹽度與LB01發光強度的關系Fig. 6 Effects on the luminescence of LB01 by salinity

圖7 LB01菌液密度與發光強度的關系Fig. 7 Effects on the luminescence of LB01 by the density of bacteria suspension

表2 培養時間對發光的影響Tab. 2 Effects on the luminescence of LB01 by culture time

3 討 論

自黑鯛腸道分離到一株發光細菌 LB01，對其進行了形態學觀察、生理生化特性鑒定及16S rRNA基因序列的分析。該菌株為革蘭氏陰性桿菌，具有運動性，氧化酶和過氧化氫酶陽性、硝酸鹽降解陽性、發酵葡萄糖不產氣，符合《伯杰氏細菌鑒定手冊》[9]對發光桿菌屬的描述；其它主要理化特性如下：精氨酸雙水解酶陽性，生長需Na+，4℃生長，不產生淀粉酶、脂酶和明膠酶；能利用纖維二糖、半乳糖、甘露糖等作為單一碳源；對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[9]和相關文獻[12]，LB01可以初步鑒定為發光桿菌屬的鰒發光桿菌。

16S rRNA基因序列比對結果表明，LB01與數種發光桿菌屬種類的同源性均很高，達到 99%以上，包括鰒發光桿菌、P. kishitanii、明亮發光桿菌和 P. iliopiscarium等。系統發育分析表明，LB01與鰒發光桿菌（AY292947）聚為一類，同源性達100%。已有研究表明，上述4種發光桿菌本身在生理生化特性上極為相似，16S rDNA序列同源性也極高，但在部分遺傳特性及宿主特性上存在顯著差異，屬于不同的種[12-15]；其中后三者的理化特性極為相近，P. kishitanii和P. illopiscarium是最近才從明亮發光桿菌中分離出來的[13,14]；鰒發光桿菌和明亮發光桿菌在數種理化特性上存在明顯差異，前者氧化酶反應陽性，發酵葡萄糖不產氣；而后者氧化酶試驗陰性，發酵葡萄糖產氣[9,13]。分析比較LB01與鰒發光桿菌和明亮發光桿菌的理化特性，LB01更接近于鰒發光桿菌；結合16S rRNA序列同源性分析，可以判斷為鰒發光桿菌。

中國學者于20世紀80年代對國內沿海的發光細菌資源進行了調查，發現了包括鰒發光桿菌、發光性哈維氏弧菌（V. harveyi）和費氏發光弧菌(V.fischeri)等主要種類的發光細菌，其中鰒發光桿菌在我國沿海海域自南到北皆有分布[16-19]。本研究則首次自東海網箱養殖海水魚—黑鯛腸道內分離到一株鰒發光桿菌，驗證了該菌在海水動物體內的定殖；發光細菌在海洋動物發光器官與腸道中的定殖其實與這些菌種在海水中的分布是對應的[15,20]。

已經報道的海洋發光細菌發射波長為 450～490 nm[1]，本研究中LB01菌株在培養條件下發出藍綠色光，在黑暗條件下肉眼可見，最大發射波長在470 nm左右，與已有報道相符。在pH 值6.0左右，溫度20℃，NaCl濃度3%，發光最強，與明亮發光桿菌的發光條件相近[21,22]；與國內方宏達等報道的一株海洋發光弧菌 D2的發光條件也比較接近[23]，而與杜宗軍等分離的一株發光哈維氏弧菌D40發光條件則略顯差異，后者發光溫度和pH值范圍更廣一些[8]。鰒發光桿菌作為一種海洋細菌，其生長和發光均需較高的鹽度，研究中觀察到，LB01在2216E培養基、發光培養基上均能正常生長，發光情況則是后者優于前者，這是由于在培養基中添加了甘油和鈣鹽等有利于發光反應的進行的緣故。

明亮發光桿菌與費氏弧菌均為生物發光傳感器中應用的重要菌種[22,24,25]；目前國內應用的主要是國外分離株[4-7]。本研究自東海海域網箱養殖黑鯛腸道內分離到一株鰒發光桿菌，其發光條件和發光特性與明亮發光桿菌相近，有可能在生物發光傳感器中獲得應用。

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Isolation and identification of a luminous bacterium LB01 and primary studies on its luminescent conditions

MAO Zhi-juan, YANG Ji-fang, WANG Jing, HUANG Ju-jue

(Biological and Environmental College, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China)

A luminous bacterium, LB01, was isolated from the gut of a net caged black sea bream (Sparus macrocephlus). Based on the morphology profiles, the physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequencing analysis，strain LB01 was identified as Photobacterium leiognathi．And the luminescent conditions were preliminary determined. The strain irradiated fluorescent light at a wavelength of about 470nm. In liquid culture, under the following conditions, pH value of 5.0～6.0, detection temperature at 20℃, with 3 % NaCl in the detection buffer，the luminous bacterium LB01 showed the strongest luminescence.

Photobacterium leiognathi; identification; luminescent conditions

S942.1

A

1001-6932(2011)04-0441-06

2010-8-31；

2011-2-15

海洋公益性行業科研專項基金 ( 200705014)。

毛芝娟（1973－），女，博士，主要從事海洋病原微生物學研究。電子郵箱：zhijuanmao@tom.com。