新疆酸駝乳中細菌素乳酸菌的篩選及其抑菌性

武 運李 遠王冰峰張曉燕阿伊古扎麗巴吐爾

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學科學技術學院，新疆 烏魯木齊 830052）

新疆酸駝乳中細菌素乳酸菌的篩選及其抑菌性

武 運1李 遠1王冰峰2張曉燕1阿伊古扎麗1巴吐爾1

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學科學技術學院，新疆 烏魯木齊 830052）

通過雙層瓊脂擴散打孔法，從新疆哈薩克族傳統發酵酸駝乳中分離的23株乳酸菌中，篩選出9株對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有抑菌活性的菌株（其中菌株MLS5抑菌活性最強）。通過有機酸、過氧化氫抑菌的排除試驗和蛋白酶敏感性試驗，初步確定MLS5產生的抑菌物質為蛋白質類細菌素。溫度和p H耐受試驗表明，該細菌素具有良好的熱穩定性（121℃，20 min），p H 3～6具有抑菌活性。菌株MLS5的發酵曲線表明，菌株在37℃培養條件下具有良好的產細菌素和產酸能力，該細菌素在菌體生長對數中期產生，在生長穩定期抑菌活性達到最大。經抑菌譜試驗表明，MLS5所產細菌素不僅能抑制革蘭氏陽性細菌，而且對大腸桿菌和毛霉菌也有抑制作用，具有較廣的抑菌譜。

酸駝乳；乳酸菌；細菌素；篩選；抑菌性

新疆發酵酸駝乳是由哈薩克族傳統的發酵菌發酵制備而成的，其中蘊涵著大量的微生物，尤其是乳酸菌。酸駝乳既是食品，又是一種民族藥。有研究［1］認為酸駝乳對肺結核、腸胃炎和心血管等疾病有治療作用，且具有抗炎作用，這可能與酸駝乳中的益生菌有關。

乳酸菌是一種在食品發酵工業中廣泛應用的益生菌。已有研究［2］表明有些乳酸菌代謝可以產生細菌素、有機酸、過氧化氫、雙乙酰等多種天然抑菌物質。乳酸菌細菌素是乳酸菌在代謝過程中合成并分泌到環境中的一類對親緣關系較近，有抑（殺）菌作用的蛋白或多肽類物質。很多乳酸菌都能夠產生細菌素，目前報道［3］的有40余種乳酸菌細菌素，它們對熱的敏感范圍和生化特性等有較大差異［4］。乳酸菌產生的抑菌活性代謝產物細菌素，不僅可以改善腸道生態，而且可以抑制或殺死一些病原菌和食物腐敗菌［5］。Rogers［6－7］報道了由乳酸乳球菌 （lactococcus lactis）產生的對保加利亞乳桿菌（lactobacillus bulgaricus）有抑制作用的物質乳鏈球菌肽（nisin）。自乳酸乳球菌產生的細菌素Nisin獲準作為安全性高的食品防腐劑以來，細菌素的研究已成為微生物學研究中一個活躍的領域［8］。

本試驗就新疆哈薩克族傳統發酵酸駝乳中產細菌素的乳酸菌進行篩選，并對其抑菌性進行初步研究，以期為中國傳統食品中優良菌株的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌株

23株乳酸菌：分離自新疆哈薩克族傳統發酵酸駝乳；

金黃色葡萄球菌 （staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）、大腸桿菌（escherichia coli）、釀酒酵母（saccharomyces cerevisiae）、灰綠青霉（penicillium glaucum）和毛霉菌（mucor）：本實驗室提供；

蠟樣芽孢桿菌（bacillus cereus）、堅強腸球菌（enterococcus durans） 和 巴 斯 德 醋 酸 菌 （acetobacter pasteurianus）：分離自發酵食品。

1.1.2 培養基 MRS培養基［9］，用于培養乳酸菌；營養瓊脂培養基［10］，用于抑菌試驗；LB培養基［10］，用于培養指示細菌；察氏培養基［10］，用于培養酵母及霉菌。

1.1.3 試劑過氧化氫酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶：Sigma公司；蛋白酶K：北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.4 儀器

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：LD2X－30KA，上海申安醫療器械廠；

生物安全柜：HR40－ⅡA2，青島海爾特種電器有限公司；

電熱恒溫培養箱：DHP－9162，上海一恒科技有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW－D2，北京永光明醫療儀器廠；

生物顯微鏡：XSP－2CA，廈門Motic實業集團有限公司；

臺式離心機：GL－100，上海安婷科學儀器廠；

手持p H計：TRANS WIGGENS，Senz Pal公司。

1.2 方法

1.2.1 產細菌素菌株的篩選

（1）乳酸菌發酵液的制備：將活化后的乳酸菌發酵液以1%的接種量分別接種于10 m L裝有MRS液體培養基的Ep管中［11］，37 ℃ 培 養 箱 恒 溫 培 養 24 h，1 000 r／min 離 心10 min，收集上清液。

（2）指示菌菌懸液的制備：以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌為菌株篩選的指示菌，將活化后的指示菌發酵液以1%的接種量接種于50 m L LB液體培養基中，37℃ 培養箱恒溫培養24 h。

（3）篩選方法：采用雙層瓊脂孔洞法。將10 mL滅菌的營養瓊脂培養基（瓊脂含量2%）傾注于直徑90 mm的培養皿中，保持水平待其凝固作為底層，加入1 m L指示菌液，傾入20 m L冷卻至45℃的LB培養基（瓊脂含量0.75%［12］），輕搖混勻后水平放置使其凝固，作為菌層。10 mL營養瓊脂培養基不做培養菌體用。其作用：① 使皿底均勻，減小試驗誤差；② 做緩沖層，防止菌液擴散過快或過慢以至擴散不均；③ 膠粘作用，防止菌液滲漏影響抑菌效果。抑菌試驗實際培養基為20 m L。通過預試驗顯示，加底層培養基抑菌效果明顯好于不加底層的。用直徑10 mm的無菌打孔器在菌層打孔后，用無菌鑷子將孔中央菌層培養基夾出，使其形成直徑10 mm的圓孔，向孔洞內加入待試乳酸菌發酵上清液150μL，以滅菌 MRS液體培養基為空白對照，37℃培養24 h后觀察有無抑菌圈形成，并測量其抑菌直徑。

1.2.2 細菌素蛋白質性質的確定 采用逐步排除干擾因素的方法，確定有抑菌作用的菌株產生的細菌素的蛋白質性質。

（1）有機酸抑菌的排除試驗：先用1 mol／L NaOH和1 mol／L HCl調發酵上清液的p H 值分別為3.5，4.5，5.5，6.5，以相應p H值的乳酸為對照，進行抑菌試驗，確定對照p H值。將發酵上清液調至對照p H值，以相應p H值的MRS液體培養基為對照，進行抑菌試驗。指示菌為金黃色葡萄球菌。

（2）過氧化氫抑菌的排除試驗：用1 mol／L NaOH和1 mol／L HCl將發酵上清液調至過氧化氫酶的最適作用p H值7.0，將發酵上清液用1 mol／L的過氧化氫酶在37℃水浴1 h，再將p H值調回對照p H值，以未經酶處理的發酵上清液為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌進行抑菌試驗。

（3）細菌素的蛋白酶敏感性試驗：用蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K）對發酵上清液進行酶分解試驗。先用1 mol／L NaOH和1 mol／L HCl分別將發酵上清液調至蛋白酶的最適作用p H值（胃蛋白酶調至3.0，胰蛋白酶和蛋白酶 K調至7.0），按1 mg／m L加入蛋白酶，37℃水浴2 h，再將p H值調回對照p H值，以未經酶處理的發酵上清液為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌進行抑菌試驗。

1.2.3 細菌素對溫度和p H值的耐受性試驗

（1）細菌素對溫度的耐受性試驗：將發酵上清液分別于60，80，100，121℃加熱處理20 min，以未經加熱處理的發酵上清液為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌進行抑菌試驗。

（2）細菌素對p H值的耐受性試驗：將發酵上清液分別調 p H 值為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，測定其抑菌圈大小，以相應p H值的MRS液體培養基為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌進行抑菌試驗。

1.2.4 產細菌素乳酸菌的發酵曲線

（1）產細菌素乳酸菌培養溫度的確定：將活化后的細菌素高產菌株培養液以1%的接種量分別接種于10 mL裝有MRS液體培養基的Ep管中，分別于30，37，42℃培養箱恒溫培養24 h，以MRS液體培養基為空白對照，每隔2 h在600 nm處分別測其光密度值（OD）及發酵上清液的p H值，并以金黃色葡萄球菌為指示菌測其抑菌活性。

（2）產細菌素乳酸菌的發酵曲線：以1.2.4（1）中確定的培養溫度，繪制產細菌素乳酸菌24 h內的發酵曲線。

1.2.5 抑菌譜的測定 取細菌素高產菌株的發酵上清液，選取革蘭氏陽性細菌（金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、堅強腸球菌、枯草芽孢桿菌），革蘭氏陰性細菌（大腸桿菌、巴斯德醋酸桿菌）和真菌（啤酒酵母菌、灰綠青霉菌、毛霉菌）作為指示菌，用雙層瓊脂孔洞法檢測細菌素的抑菌譜。

2 結果與分析

2.1 產細菌素乳酸菌的篩選結果

各供試乳酸菌產細菌素的的抑菌活性如表1所示，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌3種指示菌均有抑菌活性的菌株有9株，其中MLS5菌株的抑菌活性最強，抑菌圈的直徑分別達22.6，22.0，21.3 mm。

表1 產細菌素乳酸菌篩選結果+Table 1 Results on screening of bacteriocinproducing lactic acid bacteria

2.2 細菌素蛋白質性質的確定

2.2.1 有機酸抑菌的排除試驗結果 乳酸菌發酵液對指示菌的抑制作用可能是代謝合成的細菌素引起的，也可能是發酵產物如乳酸、乙酸及其它有機酸作用的結果。菌株MLS5的發酵上清液的試驗結果見表2和圖1，當p H值為4.5時，乳酸對指示菌沒有作用，而發酵上清液對指示菌有抑制，可見有機酸對指示菌沒有抑菌性，可排除有機酸的干擾。

表2 對照p H值的確定結果+Table 2 Results of compare p H value

圖1 有機酸抑菌的排除試驗結果Figure 1 Results on inhibitive effect of organic acids exclusion test

2.2.2 過氧化氫抑菌的排除試驗結果 乳酸菌在代謝過程中產生的強氧化劑過氧化氫也可以抑制細菌的生長，因此必須排除過氧化氫的干擾。菌株MLS5的發酵上清液過氧化氫排除的試驗結果見表3，過氧化氫對指示菌抑制作用很小，從而排除過氧化氫對細菌素抑菌活性的干擾。

表3 過氧化氫抑菌的排除和蛋白酶敏感性試驗結果+Table 3 Results on inhibitive effect of organic acids exclusion test and protease susceptibility test

2.2.3 細菌素的蛋白酶敏感性試驗結果 乳酸菌發酵液中，為了確定對指示菌的抑制作用為蛋白質類細菌素，經胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K分別對發酵上清液進行酶解后的抑菌試驗結果見表3。發酵上清液對胃蛋白酶不敏感，而對胰蛋白酶和蛋白酶K敏感，從而初步確定發酵上清液中的抑菌物質為蛋白質類細菌素。

2.3 細菌素對溫度和p H值的耐受性試驗結果

2.3.1 細菌素對溫度的耐受性試驗結果 細菌素對溫度的耐受性試驗結果見表4。由表4可知，發酵上清液在不同溫度加熱處理后仍具有較強的抑菌活性，121℃處理20 min后抑菌圈直徑為20.1 mm，抑菌活性相對于發酵上清液原液略有降低，但抑菌活性仍然較明顯。

表4 細菌素對溫度的耐受性試驗結果Table 4 Results on temperature tolerance of bacteriocin

2.3.2 細菌素對p H的耐受性試驗結果 細菌素對p H的耐受性試驗結果見表5。發酵上清液在p H 3～6的范圍內具有抑菌活性，隨著p H的升高抑菌活性逐漸下降，至p H 7時，細菌素已不具有抑菌活性。

表5 細菌素對p H的耐受性試驗結果+Table 5 Results on p H tolerance test of bacteriocin

2.4 菌株MLS5的發酵曲線結果

菌株MLS5在30，37，42℃條件下的生長、p H及抑菌試驗結果表明，當培養溫度為37℃時，MLS5的生長、產酸及抑菌活性均優于30℃和42℃，因此，將37℃確定為MLS5的培養溫度。菌株MLS5在37℃培養24 h的發酵曲線見圖2。由圖2可知，菌株MLS5培養2～4 h進入對數生長期，p H值降低，培養4～6 h發酵上清液開始具有抑菌活性。

圖2 菌株MLS5 37℃的發酵曲線Figure 2 Fermentation curve of strain MLS5 at the temperature of 37℃

隨著培養時間的延長，發酵上清液的抑菌活性逐漸增強，p H值逐漸降低。菌體生長至14 h時，其抑菌活性達到最大直徑為22.4 mm，p H達到最低3.97。14 h后，菌體生長進入穩定期，其抑菌活性及p H值變化也趨于穩定。

2.5 抑菌譜的測定

菌株MLS5細菌素的抑菌譜試驗結果見表6。由表6可知，菌株MLS5產生的細菌素不僅能抑制革蘭氏陽性細菌，對大腸桿菌和毛霉也有較好的抑制作用，因而該細菌素具有較廣的抑菌譜。

表6 菌株MLS5細菌素的抑菌譜試驗結果+Table 6 Results on antibacterial spectrum of MLS5 bacteriocin

3 結論

（1）從新疆哈薩克族傳統發酵酸駝乳中分離的23株乳酸菌中，通過雙層瓊脂擴散打孔法篩選出9株對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌具有抑菌活性的菌株，其中菌株MLS5抑菌活性最強，抑菌圈的直徑分別達22.6，22.0，21.3 mm。

（2）通過有機酸、過氧化氫抑菌的排除試驗和蛋白酶敏感性試驗，排除有機酸、過氧化氫抑菌的干擾，并初步確定MLS5產生的抑菌物質為具有蛋白質性質的細菌素。

（3）溫度和p H耐受試驗表明，乳酸菌MLS5產生的細菌素具有良好的熱穩定性（121℃，20 min），p H 3～6具有抑菌活性，隨著p H的升高抑菌活性逐漸下降。

（4）菌株MLS5的發酵曲線表明，菌株在37℃培養條件下具有良好的產細菌素和產酸能力，該細菌素在菌體生長對數中期產生，在生長穩定期抑菌活性達到最大。

（5）經抑菌譜試驗表明，菌株MLS5發酵液不僅能抑制革蘭氏陽性細菌，對大腸桿菌和毛霉也有較好的抑制作用，因而該細菌素具有較廣的抑菌譜。

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12 李秀涼，雷虹，孟博，等.肽類抑菌物質效價的測定［J］.食品科技，2006（3）：113～115.

Screening of bacteriocin－producing lactic acid bacteria in hogormag from Xinjiang and study on its bacteriostatic activity

WU Yun1LI Yuan1WANG Bing－feng2ZHANG Xaio－yan1Ayguzal1Batuer1

（1.College of Food Sciences and Pharmaceutical Sciences，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang830052，China；2.College of Science and Technology，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang830052，China）

From 23 strains of lactic acid bacteria isolated from Hazakh traditional fermented camel milk，9 Strains were screened out to exhibit inhibitory activity onS.aureus，B.subtilisandE.coliby doubledeck agar diffusion and punch methods.One strain of MLS5 exhibits the strongest antibacterial activity.The antimicrobial substance produced by MLS5 was initially identified as protein bacteriocin by inhibitive effect of organic acids and hydrogen peroxide exclusion and protease susceptibility test.Temperature and p H tolerance test showed that the bacteriocin still has thermal stability at 121℃for 20 minutes and antibacterial activity at p H 3～6.Fermentation curve of strain MLS5 showed that the strain was capacity of producing bacteriocin and acid at the temperature of 37℃.The bacteriocin was generated from mid－logarithmic growth phase and reached the maximum activity at stationary phase.The inhibitory spectrum results showed that the bacteriocin produced by MLS5 exhibits broad antibacterial spectrum.It can not only inhibit the Gram－positive bacteria，but also inhibitE.coliandMucor.

fermented camel milk；lactic acid bacteria；bacteriocin；screening；antibacterial activity

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.008

國家公益性行業（農業）科研專項（編號：200803033－A09011）；新疆農業大學緊缺人才專業大學生創新項目（編號：jqrcp2201003）

武運（1965－），女，新疆農業大學副教授，碩士。E－mail：wuyunster＠sina.com

巴吐爾

2011－03－09