雙酶復(fù)合法提取蛋殼膜中透明質(zhì)酸的研究

皮鈺珍 李佳音 賀 亮

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

雙酶復(fù)合法提取蛋殼膜中透明質(zhì)酸的研究

皮鈺珍 李佳音 賀 亮

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

利用雙酶復(fù)合法，以胰蛋白酶、木瓜蛋白酶復(fù)合提取蛋殼膜中透明質(zhì)酸，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)確定雙酶法提取透明質(zhì)酸的最佳工藝條件：料液比1∶40（m∶V），木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的活性比1∶1，酶用量1 240U／g，溫度50℃，pH值7.3，提取時(shí)間6h。該條件下，蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取量為12.2mg／g·蛋殼膜。

蛋殼膜；雙酶酶解；透明質(zhì)酸

蛋殼膜是位于蛋殼與蛋清之間的雙層纖維狀薄膜［1］，是一種以角膜為主體，與黏多糖類相結(jié)合的復(fù)合蛋白質(zhì)，其中含有N－乙酰氨基葡萄糖半乳、葡萄糖醛酸、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等多糖化合物［2］。

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，簡(jiǎn)稱HA），是一種具有特殊功能的線性大分子黏多糖，廣泛存在于結(jié)締組織及某些生物莢膜中。它由葡萄糖醛酸和N－乙酰氨基葡萄糖的雙糖單位反復(fù)交替連接而成，分子式為（C14H21NO11）n［3］。HA具有較強(qiáng)的保水能力，被譽(yù)為理想的天然保濕因子，廣泛應(yīng)用于高檔護(hù)膚品、潔齒品以及醫(yī)療用品［4，5］。但是由于原料資源的限制，目前中國(guó)HA的產(chǎn)量不能滿足市場(chǎng)需求。許多研究［6］表明在蛋殼膜中已探測(cè)到一定數(shù)量的HA，占濕膜重量的0.5%～10%，因此，蛋殼膜可作為提取HA的資源。中國(guó)每年約產(chǎn)生246萬(wàn)t蛋殼，其中蛋殼膜約為17萬(wàn)t，它們都被視為廢棄物。本試驗(yàn)通過(guò)酶解蛋殼膜，從中提取有效成分HA，既可以減少對(duì)環(huán)境的污染，還可以創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 原料

雞蛋殼：沈陽(yáng)市某蛋糕店；

胰蛋白酶（250U／mg）、Alcalase酶（2 000U／mL）、中性蛋白酶（2 500U／mL）、木瓜蛋白酶（6 000U／mg）、堿性蛋白酶（2 000U／mg）：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試劑

HCl、95%乙醇、100%乙醇、三氯乙酸、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品：均為市售分析純。

1.3 設(shè)備

電子分析天平：ALC－210.4，深圳市標(biāo)雅科技有限公司；

粉碎機(jī)：DFT－50，溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司；

pH計(jì)：PHS－25，上海日島科學(xué)儀器有限公司；

真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52B，上海亞榮生化儀器廠；

離心機(jī)：H－1650，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV－2102C，尤尼柯（上海）儀器有限公司；

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 原料處理

清洗過(guò)的蛋殼放置于清水中24h→加入稀HCl→放置2h→攪拌使殼膜分離→清水洗滌蛋殼膜除去酸液→干燥蛋殼膜→粉碎制粉

1.4.2 HA的粗提取

蛋殼膜粉→加入1%～2%氯化鈉→90℃下攪拌，保溫10min→冷卻至室溫→調(diào)pH值→加酶酶解→離心過(guò)濾收集上清液→濃縮→95%乙醇醇沉2次離心留沉淀→1%氯化鈉將沉淀溶解→加三氯乙酸→離心收集上清液→濃縮→再次用95%乙醇醇沉2次，離心留沉淀→真空干燥得HA粗品

1.4.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 在試驗(yàn)過(guò)程中分別考察酶用量、pH、溫度、酶解時(shí)間對(duì)HA提取量的影響，以HA提取量為評(píng)定指標(biāo)。

（1）酶用量對(duì)HA提取量的影響：取一定量過(guò)篩蛋殼膜，在料液比1∶40（m∶V），溫度50℃的條件下，酶解6h。二酶活力比1∶1，酶用量取1 000，1 250，1 500，1 750，2 000U／g 5個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。

（2）pH對(duì)HA提取量的影響：取一定量過(guò)篩蛋殼膜，在料液比1∶40（m∶V），二酶活力比1∶1，酶用量1 250U／g，溫度50℃的條件下酶解6h。pH 值選6.5，7.0，7.5，8.0，8.5 5個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。

（3）溫度對(duì)HA提取量的影響：取一定量過(guò)篩蛋殼膜，在料液比1∶40（m∶V），二酶活力比1∶1，酶用量1 250U／g，pH 7.5的條件下酶解6h。酶解溫度取45，50，55，60，65℃5個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。

（4）時(shí)間對(duì)HA提取量的影響：取一定量蛋殼膜，在料液比1∶40（m∶V），二酶活力比1∶1，酶用量1 250U／g，pH 7.5，溫度50℃的條件下酶解。酶解時(shí)間取3，4，5，6，7h 5個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 根據(jù)Box－Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)HA提取影響顯著的4個(gè)因素（酶用量，pH，溫度，酶解時(shí)間），設(shè)計(jì)四元三次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合的響應(yīng)面分析試驗(yàn)［7］。

1.4.5 HA含量的測(cè)定 因?yàn)闊o(wú)論何種來(lái)源的HA，均由D－葡萄糖醛酸和乙酰氨基－D－葡萄糖按1∶1的摩爾比組成，根據(jù)HA的結(jié)構(gòu)計(jì)算，葡萄糖醛酸在HA中的含量為48.38%，所以通過(guò)測(cè)定葡萄糖醛酸的含量即得出HA的含量，葡萄糖醛酸含量采用 Bitter－Muir咔唑法［8，9］測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定最佳酶系組合

選用中性蛋白酶、Alcalase酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶對(duì)蛋殼膜進(jìn)行酶解［10，11］，篩選出最佳酶系組合。

由表1可知，使用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解蛋殼膜所得 HA的提取量最高，分別是11.9，11.5mg／g，因此選用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶組成最佳酶解酶系，進(jìn)行以下最佳提取工藝的研究。

2.2 雙酶酶解的最佳工藝的研究

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

2.2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果 以酶用量，pH，溫度，酶解時(shí)間為自變量，以HA提取量為響應(yīng)值，根據(jù)四元三次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排，進(jìn)行27次試驗(yàn)，試驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 酶對(duì)HA提取量的影響Table 1 The influence of enzyme on the yielding rate of HA

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiment

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface test results

采用Design－Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到蛋殼膜中提取HA的回歸方程：

由表4可知，對(duì)HA提取量的方差分析，其線性、平方以及交互項(xiàng)的顯著性P＜0.05，回歸達(dá)到顯著水平。圖1～3說(shuō)明響應(yīng)值與各因素之間存在的顯著回歸關(guān)系。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for second－order polynomial model fitted to the response variable

圖1 酶用量和酶解時(shí)間對(duì)提取量的交互影響Figure 1 The contour plot of effect of enzyme amount and extraction time on the yielding rate of HA

圖2 pH和酶用量對(duì)提取量的交互影響Figure 2 The contour plot of effect of pH and enzyme amount on the yielding rate of HA

圖3 酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)提取量的交互影響Figure 3 The contour plot of effect of extraction temperature and extraction time on the yielding rate of HA

通過(guò)對(duì)二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型的解逆矩陣，并結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)操作，確定雙酶復(fù)合提取蛋殼膜中HA的最佳生產(chǎn)工藝為在料液比1∶40（m∶V），木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的活性比1∶1，酶用量為1 240U／g，pH值7.3，溫度50℃的條件下酶解時(shí)間6h，得到HA的提取量為12.2mg／g·蛋殼膜，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，該值與響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)值12.5mg／g·蛋殼膜非常接近，表明模型是合理有效的。

3 結(jié)論

影響雙酶法提取蛋殼膜中HA主次因素順序：酶解溫度＞酶解時(shí)間＞pH＞酶用量。最佳酶解提取工藝：在料液比1∶40（m∶V），木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的活性比1∶1，酶用量1 240U／g，pH值7.3，溫度50℃的條件下酶解6h，HA的提取量可達(dá)12.2mg／g·蛋殼膜。

1 趙玉紅，韓琳琳，遲玉杰.酶法提取雞蛋殼膜中透明質(zhì)酸的研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29（1）：40～43.

2 馬朝梅.發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸工藝研究［J］.廣西工學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，9（3）：3～4.

3 顏延寧.雞冠中透明質(zhì)酸的提取［J］.廣西輕工業(yè)，2006，9（5）：40～42.

4 郭育濤，陳斌，江元汝，等.從牛眼玻璃體中分離純化透明質(zhì)酸的新方法［J］.精細(xì)化工，2008，3（3）：3～4.

5 趙玉紅，遲玉杰.蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取及部分特性研究［J］.食品工業(yè)科技，2008（6）：172～174.

6 Long，F(xiàn)rank Daniel，Adams，et al.Preparation of hyaluronicacid from eggshellmembrane：America，6946551.B2［P］.2005－09－20.

7 慕運(yùn)動(dòng).響應(yīng)面方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，22（3）：91～94.

8 Bitter T，Muri H M.A modified uronic acid carbazole reaction［J］.Anal.biochem，1962（4）：330～333.

9 凌沛學(xué).透明質(zhì)酸［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2007：15～47

10 胡耀輝.食品生物化學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：74～79.

11 袁勤生.酶與酶工程［M］.上海：華東理工大學(xué)，2005：130～145.

Extracting hyaluronic acid from eggshell membrane with double－enzyme

PI Yu－zhen LI Jia－yin HE Liang

（Food College，Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning110866，China）

The hyaluronic acid was extracted from eggshell membrane by double－enzyme with the complex of trypsinase and papain.Through response surface method，the best extracting conditons of hyaluronic acid were as followed：ratio of solid to liquid 1∶40，amount of enzyme 1 240U／g，reaction temperature 50℃，hydrolysis time 6h，pH 7.3.Under the condition，the hyaluronic acid yielding rate reached 12.2mg／g.

eggshell membrane；double－enzyme enzymic hydrolysis；hyaluronic acid

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.04.010

皮鈺珍（1974－），女，沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)副教授，博士。E－mail：yuzhen＿pi＠sina.com

2011－04－11