蝙蝠葛堿提多糖對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

王志宏，薛建斌，姜文艷，張桂榮

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130117；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012）

蝙蝠葛堿提多糖對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

王志宏1，薛建斌2，姜文艷2，張桂榮2

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130117；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012）

利用蝙蝠葛根提取多糖成分，并應(yīng)用噻唑藍(lán)還原法（MTT）檢測(cè)了蝙蝠葛多糖對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用及細(xì)胞毒性作用.結(jié)果表明：蝙蝠葛堿提多糖在質(zhì)量濃度較低時(shí)，對(duì)Hela細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，此作用在質(zhì)量濃度為0.25 mg／m L時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)Hela細(xì)胞增殖率為149%.隨著濃度的進(jìn)一步加大，Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)逐漸受到抑制，增殖率逐漸下降.在多糖質(zhì)量濃度為0.60～0.65 mg／m L時(shí)，Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)能力迅速下降，增殖率下降達(dá)約256%，且隨著蝙蝠葛多糖質(zhì)量濃度的增長(zhǎng)，其對(duì)Hela細(xì)胞有進(jìn)一步的抑制作用，但影響水平較為緩和，表明蝙蝠葛多糖具有明顯的抗腫瘤作用.

蝙蝠葛；多糖；癌癥

防己科植物蝙蝠葛（MenispermumdauricumDC），又名北豆根，始載于《中國(guó)藥植志》，具有清熱解毒、祛風(fēng)止痛、理氣化濕之功效.以往的研究多述及蝙蝠葛根的抑菌作用、降壓作用及抗心率失常作用等，其有效成分為生物堿［1－3］.另有研究發(fā)現(xiàn)，蝙蝠葛具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，根提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有廣譜的抑制作用，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并有免疫調(diào)節(jié)作用［4－6］.中藥多糖具有提高免疫力、抗腫瘤作用［7］，蝙蝠葛多糖的直接和間接致突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，直接和間接抗突變結(jié)果為陽(yáng)性，并且具有濃度依賴性［8］，顯示了其良好的抗腫瘤前景.

1 材料和方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

Hela細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；蝙蝠葛根為市售；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、MTT為GIBCO公司產(chǎn)品，DMSO（美國(guó)），NaOH、無(wú)水乙醇、鹽酸、聚乙二醇均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

主要設(shè)備：超低溫電冰箱（日本三洋MDF－492），高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Centrifuge5810R），電子分析天平（德國(guó)賽多利斯BP221S），電磁爐，紅外爐，凍干機(jī)（ALPHA1RZ6），酸度計(jì)等.

1.2 蝙蝠葛堿提多糖的制備

取800 g蝙蝠葛根，加入4 L去離子水，中火煮沸2.5 h，過(guò)濾.濾渣重復(fù)上述操作3次，最后將水提后的濾渣用4 L 0.1 mol／L的NaOH浸泡過(guò)夜，中火煮沸2.5 h，過(guò)濾，留濾液.向?yàn)V渣中加入去離子水，用NaOH溶液調(diào)p H＝13，中火煮沸2.5 h，過(guò)濾，重復(fù)上述操作3次，合并濾液；用HCl調(diào)濾液p H＝7，用中火繼續(xù)煮沸濾液進(jìn)行濃縮，得到蝙蝠葛堿提多糖的粗提液（BJT）.

1.3 蝙蝠葛堿提多糖的分級(jí)純化及含量的測(cè)定

在BJT中加入75%無(wú)水乙醇，醇沉過(guò)夜.將醇沉所得混合物5 000 r／min離心5 min，－80℃預(yù)凍，凍干；用研缽研碎，過(guò)篩，獲得0.15 mm顆粒，干燥即為蝙蝠葛堿提多糖（BJT1）.

取BJT1溶解于去離子水中達(dá)到飽和，5 000 r／min離心5 min.取適量上清裝入透析袋中，流水透析；當(dāng)透析袋快裝滿時(shí)，將其取出，置于聚乙二醇中干燥.重復(fù)上述操作多次，直至沒(méi)有明顯的透析現(xiàn)象.將透析袋中溶液取出干燥，密封保存.

1.4 蝙蝠葛堿提多糖含量的測(cè)定

利用蒽酮硫酸法進(jìn)行多糖含量的測(cè)定.

2 g／L蒽酮試劑的配制：取2 g蒽酮溶解到80%H2SO4中，并以80%H2SO4定容到1 000 m L，當(dāng)日配制使用.

圖1 蒽酮濃硫酸法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

0.1 g／L葡萄糖溶液的配制：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖0.01 g，用少量蒸餾水溶解后定容至100 mL容量瓶中.

精密稱取0.1 g／L葡萄糖溶液0.10，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80 m L至6支試管中，然后將每支試管中溶液用蒸餾水補(bǔ)足至1 m L，混勻；加入4.00 m L蒽酮試劑，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起用玻璃球?qū)⒐芸谏w住，浸于沸水浴中，自水浴重新煮沸起，準(zhǔn)確煮沸10 min，取出，流水冷卻，室溫放置10 min左右，測(cè)620 nm處吸光度值.以蒸餾水作為空白樣品對(duì)照，以620 nm處吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1）.

1.5 Hela細(xì)胞的培養(yǎng)

取出凍存細(xì)胞，迅速置于37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)凍存管，待其內(nèi)容物融化后，將凍存管從水浴中取出，酒精消毒后開啟.用吸管將細(xì)胞懸液吸入離心管，并滴加10倍的RPMI 1640培養(yǎng)液，混合后1 500 r／min離心5 min，除去上清液，加入新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液.待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%飽和時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代.

1.6 BJT1體外抑制Hela細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1.6.1 BJT1溶液的配制

取上述純化后的BJT1 20 mg，溶于20 m L RPMI 1640培養(yǎng)液中.溶液用0.22μm的針頭濾器過(guò)濾除菌后，按表1建立濃度梯度，4℃貯存?zhèn)溆?

表1 蝙蝠葛堿提多糖濃度梯度的建立

1.6.2 原位培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變

設(shè)空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（建立梯度0.50，0.25，0.05，0.025，0.01 mg／m L），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔.培養(yǎng)24 h后加藥，培養(yǎng)48 h后，在倒置光學(xué)相差顯微鏡下觀察并拍攝記錄.

1.6.3 噻唑藍(lán)還原法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞毒性作用

將備用的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，100μL／孔，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔.將細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育.24 h后按實(shí)驗(yàn)要求加入不同稀釋濃度的BJT1，200μL／孔，同時(shí)設(shè)溶劑培養(yǎng)液為陰性對(duì)照組、無(wú)細(xì)胞組為空白對(duì)照組.將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h.實(shí)驗(yàn)終止前每孔加入5 mg／m L的MTT溶液20μL，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，避光繼續(xù)孵育4 h；去除培養(yǎng)液，加入150μL的DMSO，振蕩6 min，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的D（570）值.求平均值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率［9－18］.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 BJT1含量的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)最終得到蝙蝠葛堿提多糖56.1 g，多糖含量分別為68%和87%，兩種多糖在煮沸濃縮后都呈棕黑色微黏稠狀液體.醇沉過(guò)夜后，多糖呈糖樣黏稠狀固體.凍干后為黑褐色粉末.

2.2 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

利用倒置光學(xué)相差顯微鏡觀察了蝙蝠葛多糖BJT1對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果見(jiàn)圖2.對(duì)照組Hela細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈不規(guī)則多角形，中有圓形核；生長(zhǎng)特點(diǎn)是易相連成片，相靠—緊密相連—鋪石狀.實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組相差不大，沒(méi)有觀察到經(jīng)BJT1處理后的Hela細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制的現(xiàn)象，但有少許細(xì)胞皺縮變小，形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)典型的凋亡特征性改變，即核染色質(zhì)凝集、碎裂，沿核周邊分布，包膜內(nèi)陷將內(nèi)陷細(xì)胞的內(nèi)容物包裹成凋亡小體等，與對(duì)照組典型的惡性細(xì)胞形態(tài)相差不十分明顯.

圖2 倒置顯微鏡下觀察到的Hela細(xì)胞

2.3 不同濃度蝙蝠葛堿提多糖對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)作用

蝙蝠葛堿提多糖在低質(zhì)量濃度（0.01～0.60 mg／m L）時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用（見(jiàn)表2、表3和圖3、圖4）.在蝙蝠葛堿提多糖質(zhì)量濃度為0.01～0.25 mg／mL時(shí)，細(xì)胞增殖率隨著濃度的增加而緩緩增加；在多糖質(zhì)量濃度為0.25 mg／mL時(shí)達(dá)到最大值，細(xì)胞增殖率為149%.隨后，在多糖質(zhì)量濃度為0.25～0.60 mg／mL時(shí)，細(xì)胞增殖率隨著濃度的增大而減小，但仍大于對(duì)照組.這些數(shù)據(jù)表明，在多糖質(zhì)量濃度為0.01～0.60 mg／mL時(shí)，蝙蝠葛堿提多糖能部分被Hela細(xì)胞吸收、利用，促進(jìn)其快速分裂生長(zhǎng).

表2 低質(zhì)量濃度蝙蝠葛堿提多糖對(duì)Hela細(xì)胞的作用

在多糖質(zhì)量濃度為0.60～0.65 mg／m L時(shí)，Hela細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)速度迅速減慢，細(xì)胞增殖率驟然減少達(dá)256%，顯示了較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力.蝙蝠葛多糖質(zhì)量濃度從0.65 mg／m L進(jìn)一步增加時(shí)，隨著濃度的增大，細(xì)胞增值率緩慢下降，細(xì)胞生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制（見(jiàn)表3和圖4）.

表3 高質(zhì)量濃度蝙蝠葛堿提多糖對(duì)Hela細(xì)胞的作用

圖3 Hela細(xì)胞在低質(zhì)量濃度蝙蝠葛堿提多糖作用下的增殖率

圖4 Hela細(xì)胞在高質(zhì)量濃度蝙蝠葛堿提多糖作用下的增殖率

蝙蝠葛堿提多糖粗體產(chǎn)物在低質(zhì)量濃度（0.01～0.60 mg／m L）時(shí)，對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂有促進(jìn)作用，此效應(yīng)在質(zhì)量濃度為0.25 mg／m L時(shí)達(dá)到最大值，細(xì)胞增殖率為149%.增加蝙蝠葛堿提多糖濃度，細(xì)胞的生長(zhǎng)逐漸受到抑制，在質(zhì)量濃度為0.60～0.65 mg／m L時(shí)，Hela細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)速度迅速減慢，細(xì)胞增殖率驟然減少達(dá)256%，顯示了較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用.蝙蝠葛堿提多糖對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用的機(jī)制是否與蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿相同以及BJT1的組成和結(jié)構(gòu)尚有待進(jìn)一步的研究.［19］

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A study on effects ofMenispermum dauricumalkali polysaccharide on Hela cell proliferation

WANG Zhi－h(huán)ong1，XUE Jian－bin2，JIANG Wen－yan2，ZHANG Gui－rong2
（1.Basic Medical College，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；2.Life Science College，Jilin University，Changchun 130012，China）

Alkaloids inMenispermumdauricummay inhibit tumour cell viability in virtro，and may lead to cell apoptosis.Yet，the inhibiting capability depends on its concentration and time.This experiment means to extract polysaccharides from theMenispermumdauricumroots and to measure the inhibiting effects of its alkali polysaccharide on Hela cell proliferation and cytotoxicity by MTT reduction method.The study indicates thatMenispermumdauricumalkali polysaccharides may facilitate the Hela cell proliferation when the concentration is low.The facilitation is the highest when the concentration is at its 0.25 mg／m L，with 149%Hela cell proliferation rate.As the concentration increases，the Hela cell proliferation rate is inhibited and descends gradually.When the concentration is between 0.6 mg／m L and 0.65 mg／m L，the Hela cell proliferation capability drops rapidly by about 256%，and as the concentration increases further，the inhibiting capability grows further yet insignificantly.These results showed thatMenispermumdauricumalkali polysaccharide had significant inhibiting effect in tumour.

Menispermumdauricum；polysaccharide；tumour

R 963

310·4730

A

1000－1832（2011）04－0132－05

2011－05－23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30870251，31070309）；教育部985平臺(tái)項(xiàng)目；吉林省中醫(yī)藥管理局計(jì)劃項(xiàng)目（2010－078）.

王志宏（1965—），男，副教授，主要從事中醫(yī)藥及生化藥物研究；通訊作者：張桂榮（1964—），女，博士，教授，主要從事分子生物學(xué)及生物化學(xué)研究.

方 林）