嗜熱四膜蟲腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白ABCC10基因的可變剪切分析

陸星亦, 熊 杰, 袁冬霞, 繆 煒,*

(1. 中國科學院水生生物研究所 水生生物多樣性與保護重點實驗室, 湖北 武漢 430072; 2. 中國科學院研究生院, 北京 100049)

嗜熱四膜蟲腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白ABCC10基因的可變剪切分析

陸星亦1,2, 熊 杰1,2, 袁冬霞1, 繆 煒1,*

(1.中國科學院水生生物研究所 水生生物多樣性與保護重點實驗室,湖北 武漢430072; 2.中國科學院研究生院,北京100049)

哺乳動物中腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABCT)可通過可變剪切產生多種轉錄本, 其中含有提前終止密碼子(premature terminal codon, PTC)的轉錄本還可與無義介導的mRNA降解通路(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)作用來調節蛋白的相關功能, 但這些現象尚未在低等生物的ABCT研究中發現。該文以單細胞原生動物——嗜熱四膜蟲為對象, 利用轉錄組數據發現ABCC10基因存在可變剪切, 并產生兩條轉錄本(SV1和SV2), 其中SV2在第五個內含子處發生內含子保留事件, 這段長49 bp的序列使SV2發生移碼并產生PTC。在構建NMD通路中關鍵因子UPF1基因的嗜熱四膜蟲敲降株的基礎上, 利用實時熒光定量PCR方法檢測SV2的轉錄情況。結果顯示：含有PTC的轉錄本SV2在UPF1敲降株中的轉錄水平相對于野生型顯著增加, 說明SV2可被NMD通路降解。這與高等動物中某些ABCC蛋白通過可變剪切引入含PTC轉錄本, 并能被NMD降解的方式一致, 推測該方式在真核生物中十分保守, 并在真核生物的共同祖先(the last eukaryotic common ancestor)中就已形成。

嗜熱四膜蟲; ABC轉運蛋白; 可變剪切; 實時熒光定量PCR; NMD

腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABCT) 家族是一類跨膜轉運蛋白,以主動轉運方式完成多種分子的跨膜轉運(Higgins, 1992)，其核心結構通常包括兩個高度疏水的跨膜結構域(transmembrane domain, TMD)和兩個核苷結合結構域(nucleotide binding domain, NBD)。在行使功能的時候, TMD一般形成跨膜通道供底物分子運輸, 有時也參與底物識別過程; 而NBD則負責結合并水解ATP來提供能量(Hollenstein et al, 2007)。這類蛋白廣泛存在于真核和原核生物中, 參與生物體的各種生理功能, 如養分攝取、蛋白質外排以及細胞內的跨膜轉運(Higgins, 1992)。關于人類ABCT蛋白的研究發現, 其主要功能集中在對多肽、膽固醇、甾醇、膽汁酸等物質的跨膜轉運, 也有部分ABCT蛋白作為調控元件參與功能調控, 甚至與一些遺傳性疾病有關, 如囊腫性纖維化、抗原呈遞以及癌癥的多藥耐藥性(Dean & Allikmets, 2001)。

基于結構域排列以及序列同源性, 真核生物中ABCT蛋白超家族分為7個家族, 從ABCA到ABCG(Dean et al, 2001)。其中, ABCC家族蛋白是一類與離子轉運、毒素分泌以及信號轉導相關的蛋白, 在細胞對有毒藥物的防衛過程中起重要作用。以往的研究發現, 一些ABCC家族蛋白會發生可變剪切, 產生兩種以上的轉錄本(Aherrahrou et al, 2008; Bera et al, 2002; Grant et al, 1997; Lamba et al, 2003; Stojic et al, 2007; Yabuuchi et al, 2001)。其中,人、猴子和小鼠等哺乳動物的ABCC4蛋白都具有可變剪切, 產生的轉錄本由于含有提前終止密碼子(premature terminal codon, PTC)而被無義介導的mRNA降解機制(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)降解, 并證明含有PTC的轉錄本與翻譯有密切聯系。尤其人和小鼠中發生可變剪切的序列高度相似, 提示這種可變剪切引入含PTC的轉錄本，并能被NMD降解的方式可能在哺乳動物發生分化前就已產生了(Lamba et al, 2003)。那么在低等生物中ABCC蛋白是否也存在這種機制，雖然已有大量有關ABCT蛋白的研究在細菌、單細胞真核生物和后生動物中展開, 然而在這些研究中均未見有關ABCT可變剪切的報道。

原生動物嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)是一種單細胞真核模式生物, 之前的研究基于同源比對、系統發育分析以及內含子位置保守性分析，在嗜熱四膜蟲中鑒定出165個ABCT家族基因, 其中, 60個屬于ABCC家族, 約占總數的36% (Xiong et al, 2010)。最近, 我們利用第二代高通量轉錄組測序技術完成了嗜熱四膜蟲多個生理/發育時期的轉錄組分析, 發現了超過1 200個基因存在可變剪切事件(Xiong et al, 2011), 其中有兩個ABCC家族基因, 分別是ABCC10(基因ID:TTHERM_ 00320020)和ABCC49(基因ID:TTHERM_ 00630560)。本研究確認了ABCC10基因可由可變剪切產生兩條不同的轉錄本，其中一條含有PTC。在此基礎上, 通過考察含有PTC的轉錄本在野生型與UPF1基因敲降株中的轉錄情況, 證明了含PTC的轉錄本可被NMD通路降解, 進而推測這種通過可變剪切引入含PTC轉錄本，并能被NMD降解的方式在真核生物中十分保守, 在真核生物的共同祖先(the last eukaryotic common ancestor)中就已形成。

1 材料與方法

1.1 四膜蟲的培養

嗜熱四膜蟲(Tetrahmena thermophila) CU428株系由美國羅切斯特大學Martin A. Gorovsky教授惠贈。四膜蟲培養基組分：2% Proteose Peptone (Difco)、0.1% yeast extract (Oxide)、0.2%葡萄糖(國藥集團)、0.003% Ferric citrate (Sigma), 溶于雙蒸水,經103 kPa、120 ℃滅菌15 min后冷卻至室溫。取長勢良好的對數生長期四膜蟲，按最終密度3 125 cells/mL接種于100 mL培養基中, 置于30 ℃培養箱135 r/min培養。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

取1.1中培養至對數生長期(3×105cells/mL)的嗜熱四膜蟲 3 mL至RNA酶滅活處理的EP管中,于4 500 r/min離心5 min, 富集細胞后盡快吸去上清; 馬上加1 mL Trizol (Invitrogen, USA)裂解細胞,并混勻; 振蕩30 s后靜置10 min; 加200 μL氯仿,振蕩40 s后靜置15 min; 12 000 g, 4 ℃離心20 min;吸取上清至另一EP管中, 加入相同體積異丙醇;充分混勻后于?20 ℃冰箱過夜; 過夜后，于12 000 g，4 ℃離心15 min后去上清, 用 75%乙醇（用DEPC水配置）清洗RNA沉淀兩次, 干燥后， 加50 μL DEPC水溶解總RNA; 總RNA濃度用微量分光光度計(Malcom，Japan)檢測。

將總RNA用Dnase (Promega)消化處理, 隨后用M-MLV reverse transcriptase RNase H+(TOYOBO)逆轉錄合成cDNA, 50 μL 反應體系中包括100 U酶, 5 pmol/L Random Primers (Promega), 反應步驟依照試劑說明書。

1.3 ABCC10可變剪切產生的不同轉錄本的鑒定

四膜蟲轉錄組測序所得到的reads使用Tophat和Mummer 3.0軟件比對至嗜熱四膜蟲大核基因組序列(從四膜蟲基因組數據庫下載, http://www. ciliate.org)。由于轉錄組測序使用mRNA所逆轉錄的cDNA進行測序, 因此, 如果一條read比對至基因組后中間具有gap, 并且其gap兩端分別為GT和AG(經典的內含子剪接位), 那gap區域則為內含子。根據比對的結果, 鑒定得到嗜熱四膜蟲基因的轉錄區域及所有發生內含子剪切的位點。之后利用自制的腳本程序, 比較剪切位點以及轉錄區域，鑒定包括外顯子跳躍、內含子保留、5'剪接位點選和3'剪接位點選擇在內的四種選擇性剪切類型(Xiong et al, 2011)。

根據ABCC10基因的轉錄區域, 利用腳本程序對ABCC10基因選擇性剪接產生的兩條轉錄本序列進行拼接。對拼接好的轉錄本序列, 首先使用MAFFT在線比對軟件對進行比對, 確定發生選擇性剪切的位點, 然后分別使用ORF finder工具進行翻譯, 確定PTC位置。選擇性剪切產生的轉錄本示意圖采用Fancy Gene 1.4(http://host13.bioinfo3. ifom-ieo-campus. it/fancygene/)繪制。

1.4 UPF1基因敲降細胞株的構建(NMD通路的抑制)

本研究中, ABCC10通過可變剪切產生的轉錄本中有一條包含PTC, 這樣的mRNA可能被NMD通路快速降解。結合Bruns等人建立的四膜蟲大核染色體基因敲除方法(Bruns & Cassidy-Hanley, 2000)與GJ-1000高壓氣體基因槍(新芝科技有限公司)使用說明書, 針對NMD通路關鍵因子UPF1蛋白構建敲降株載體。首先, 分別將UPF1基因(基因ID：TTHERM_00726300)5'和3'端旁側區片段(約800 bp)通過雙酶切連接插入pNeo4載體(奧地利科學院分子技術研究所Mochizuki教授饋贈)(Mochizuki, 2008)中Neo4基因的兩端(UPF1C和UPF1N方向保持一致), 構成新的載體pNeo4-UPF1N-UPF1C。然后，用雙酶切的方法回收載體上連有旁側區片段的Neo4, 以1 μg/μL 的濃度做成基因打靶子彈對四膜蟲CU428株野生型進行基因槍轉染。通過旁側區同源重組, 在巴龍霉素濃度逐漸增加條件下,Neo4基因逐漸替換基因組上的UPF1基因座, 最終篩選得到四膜蟲UPF1基因敲降細胞株。分別利用全細胞PCR以及實時熒光定量PCR證實片段已被插入以及UPF1基因表達水平下降(圖1)。

圖1 嗜熱四膜蟲UPF1基因敲降株構建示意圖Fig.1 Schematic drawing of knock-down cell line of UPF1 gene in Tetrahymena thermophila

1.5 實時熒光定量PCR檢測UPF1以及ABCC10轉錄本的表達水平

PCR反應在BIORAD Opticon 2 型實時熒光定量PCR儀上進行。轉錄本的相對表達水平由分析工具Relative Expression Software Tool (REST) 軟件經18S校正后進行分析。軟件采用的數學模型是以樣品與對照組間PCR擴增閾值循環數threshold cycle (Ct) 的差異關系為基礎計算目的基因相對表達變化倍數, 再采用ANOVA檢測結果的顯著性,P＜0.05有統計學意義(Pfaffl et al, 2002)。

為了證明ABCC10含有PTC的轉錄本SV2是否受NMD通路的降解, 分別以步驟1.2中合成的野生型和敲降株嗜熱四膜蟲的cDNA作為模板, 利用實時熒光定量PCR的方法檢測SV2的轉錄水平。我們選擇嗜熱四膜蟲18S核糖體RNA基因作為內參基因, 其正向引物序列為：5'-CCTGGGAAGG TACGGGTAAT-3', 反向引物序列為：5'-AAGGTT CACCAGACCATTCG-3'。在兩條轉錄本共有的外顯子區域設計正向引物F, 序列為：5'-TTCTGG TTTCATTATTAAGTTGCT-3', 在ABCC10_SV2第五個外顯子發生內含子保留的位點設計反向引物SV2_R, 為了減少PCR時錯配的發生和確保正確的延伸, 剪切接頭位點左邊占據13個堿基,右邊占據12個堿基, 序列為：5'-AAAATAAGCATACCC TATAGCATAA-3'。另外, 為了校正因敲降基因產生的誤差, 我們在未剪切的外顯子上設計一條反向引物Total-R, 序列為：5'-AAAGGAAGATCATCATC AATAGAAT-3', 從而檢測ABCC10基因所有mRNA的表達量(圖2A,B)(所有引物序列使用Primer5軟件設計)。Q-PCR反應體系：10 μL FastStart Universal SYBR Green Master mix (Roche), 0.4 μmol/L引物,加雙蒸水配成20 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min,中間40個循環94 ℃ 20 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s, 75 ℃讀板1 s, 接著72 ℃延伸10 min, 最后制作溶解曲線70～90℃, 以0.5 ℃/s速率讀取數據。每個cDNA樣品重復三個平行樣。

圖2 ABCC10可變剪切產生的不同轉錄本的鑒定Fig.2 Identification of ABCC10 splice variants

2 結 果

2.1 ABCC10基因可變剪切產生的不同轉錄本的鑒定

根據嗜熱四膜蟲轉錄組數據, 鑒定得到ABCC10基因發生可變剪切事件, 并拼接出兩條完整的轉錄本序列, 分別是ABCC10_SV1和ABCC10_SV2。使用MAFFT在線比對軟件比對這兩條轉錄本序列, 發現轉錄本SV2保留一段長49 bp的內含子序列。(圖2B)

我們利用ORF Finder工具在線翻譯這兩條轉錄本序列, 發現轉錄本SV2由于選擇性剪切保留一段內含子而產生PTC, 位于最后一個外顯子聯結點復合體(exon-junction complex, EJC)上游786 bp。通過NCBI BLASTP軟件, 查看兩條翻譯出的蛋白序列產生的保守結構域。轉錄本SV2翻譯產生的蛋白由于可變剪切, 比SV1的缺少C端的一個NBD, 而且破壞了第二個TMD的完整性。最后, 采用Fancy Gene 1.4 (http://host13.bioinfo3.ifom-ieo-campus.it/ fancygene/) 繪制選擇性剪切產生的轉錄本示意圖,發現在第五個內含子處發生內含子保留(圖2A)。

2.2 轉錄本ABCC10_SV2被NMD通路降解

未成熟mRNA如果在其最后一個外顯子聯結點上游 50～55 bp前存在終止密碼子則該RNA被認為存在PTC, 可能會被NMD通路的關鍵因子UPF1蛋白形成的復合體識別, 然后發生快速降解(Hentze & Kulozik, 1999)。根據2.1的ORF結果, 轉錄本SV2產生的PTC距離最后一個外顯子-外顯子聯接點（exon-exon junction）有786堿基。因此，我們推測該轉錄本會被NMD通路降解。為了考察是否ABCC10的轉錄本SV2受NMD降解, 我們檢測其轉錄水平在NMD被抑制后是否發生顯著變化。

UPF1蛋白是NMD通路的關鍵因子, 通過敲降其表達水平可以抑制NMD通路的作用, 從而影響被其靶標的轉錄本(Mendell et al, 2002)。按照步驟1.4的方法篩選得到UPF1基因的敲降株四膜蟲。按照步驟1.2的方法提取野生型和敲降株的cDNA。按照步驟1.5檢測基因UPF1相對表達水平, 相對于野生型, 敲降株cDNA中的UPF1表達水平降低到20.7%, 說明得到了UPF1的敲降株(圖3)。

圖3 UPF1和轉錄本SV2在四膜蟲野生型和敲降細胞株中的表達變化Fig.3 Gene expression levels of UPF1 and transcript SV2 in wild-type and knock-down cell lines of Tetrahymena thermophila

由于UPF1基因表達水平發生下調, NMD機制產生的功能也隨之減弱, 我們繼續按照步驟1.5中檢測轉錄本ABCC10_SV2的相對表達水平, 相對于野生型四膜蟲CU428株,UPF1敲降株的cDNA中, 轉錄本SV2的表達水平升高了22.7%,說明該含有PTC的轉錄本SV2是NMD通路的靶標(圖3)。

3 討 論

可變剪切一直被認為是產生多樣化蛋白的重要機制, 但近年來越來越多的研究發現, 它和功能調控有著密不可分的關系, 有的蛋白可以通過可變剪切移去與其他蛋白相互作用的保守域來改變自身的功能, 也有的蛋白通過可變剪切導致閱讀框發生移碼, 產生PTC后被NMD通路降解, 從而實現對表達的調節(Lareau et al, 2004)。在高等動物ABCC蛋白家族的研究中, 最早發現具有可變剪切事件的是人類的ABCC1蛋白, 其產生的三種轉錄本都保留原有的ORF(Grant et al, 1997)。之后, 在人體肝臟的cDNA克隆得到的ABCC11和ABCC12也存在可變剪切, 前者產生的轉錄本不包含PTC,后者產生的轉錄本拓撲結構相差很大且都包含PTC, 推測有不同的生物學功能(Bera et al, 2002; Yabuuchi et al, 2001)。在人類視網膜中作用的ABCC5蛋白也有三種由可變剪切產生的轉錄本,其中兩種含有PTC (Stojic et al, 2007)。這些ABCC蛋白發生可變剪切后, 有的產生含有PTC的轉錄本,并被證實與NMD通路相關。尤其值得注意的是, 人體中的ABCC4具有泵出抗HIV藥物的功能，如三氮基-胸苷-單磷酸鹽、抗病毒核苷酸, 以及抗癌藥物如硫代嘌呤, 其可變剪切產生多種含PTC的轉錄本,第一次證實ABCC蛋白具有調節自身功能的機制,并認為該機制從小鼠到人都十分保守, 提示該機制可能在哺乳動物分化前就已形成(Lamba et al, 2003)。

多細胞生物中, 很多研究已經發現可變剪切與NMD通路之間密切的聯系(Lareau et al, 2007; Lewis et al, 2003)。但單細胞生物中的相關研究卻很少, 尤其從未見有關ABCT可變剪切的研究報道。單細胞真核模式生物嗜熱四膜蟲具有清晰的遺傳背景、完備的基因組及轉錄組數據庫, 并可應用一系列成熟的遺傳操作方法與技術, 為開展相關研究提供了機會。

在本研究中, 我們利用嗜熱四膜蟲轉錄組的數據發現了一個ABCT基因(ABCC10)通過可變剪切可產生兩種轉錄本, 其中, 轉錄本ABCC10_SV2保留了第五個內含子, 并引入了PTC。由于PTC的引入, 該轉錄本產生的蛋白的保守域發生了改變：ABCC10的跨膜通道(TMD區域)發生了改變, 并且損失了一部分結合ATP的結構(NBD區域)。為了進一步了解ABCC10基因可變剪切是否與NMD通路有聯系, 我們利用實時熒光定量PCR檢測的方法,發現轉錄本ABCC10_SV2在NMD通路的功能被抑制的情況下, 轉錄水平升高了22.7%, 這說明NMD受到抑制后含PTC的SV2轉錄本降解程度顯著降低, 證實了因內含子保留而引入PTC的SV2確實可被NMD通路降解, 這與之前高等動物中ABCC家族的某些蛋白的報道結果一致, 由此推測通過可變剪切引入含PTC的轉錄本，并被NMD降解的方式在真核生物中十分保守, 其在真核生物的共同祖先(the last eukaryotic common ancestor)中就已形成。這為利用模式生物嗜熱四膜蟲來進一步探尋可變剪切與NMD通路間偶聯的作用機制及相關生物學意義提供了基礎。

致謝：本實驗所用嗜熱四膜蟲CU428株系由美國羅切斯特大學Martin A. Gorovsky教授惠贈, pNeo4載體由奧地利科學院分子技術研究所Mochizuki教授饋贈, 在此表示衷心感謝。

Aherrahrou Z, Doehring LC, Ehlers EM, Liptau H, Depping R, Linsel-Nitschke P, Kaczmarek PM, Erdmann J, Schunkert H. 2008. An alternative splice variant in Abcc6, the gene causing dystrophic calcification, leads to protein deficiency in C3H/He mice [J]. J Biol Chem,283(12): 7608-7615.

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Alternative splicing of an ATP-binding cassette transporterABCC10inTetrahymena thermophila

LU Xing-Yi1,2, XIONG Jie1,2, YUAN Dong-Xia1, MIAO Wei1,*

(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, the Chinese Academy of Science, Wuhan 430072, China;
2. Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 430072, China)

ATP-binding cassette transporters (ABCT) could generate multiple transcripts through alternative splicing (AS) in mammalian. Some AS introduced PTC (premature terminal codon)-containing isoforms of ABCT couple with NMD (nonsense-mediated mRNA decay) to regulate relevant functions. However, there are no similar reports in lower organisms. This paper focuses on the unicellular protozoaTetrahymena thermophila, based on the RNA-seq data ofTetrahymena thermophila, identified two alternative splicing variants of geneABCC10(SV1 and SV2).The SV2 contained an intron retention event at the fifth intron, and this 49 bp intron resulted in shift-frame and introduced PTC. Then, a knock-downTetrahymenastrain of geneUPF1which is a key factor of NMD was constructed, and the expression levels of SV2 were performed using a real-time quantitative PCR. The results showed the expression levels of SV2 were up-regulated significantly in knock-down strain, indicating that SV2 was targeted by NMD, which is consistent to the mechanism which the AS introduced PTC-containing isoforms of ABCC proteins can be targeted by NMD in mammalian. Thus, we infer that this mechanism is highly evolutionary conserved in eukaryotes and was already functional in the last eukaryotic common ancestor.

Tetrahymena thermophila; ABC transporter; Alternative splicing; Real-time quantitative PCR; NMD

Q959.117; Q513

A

0254-5853-(2011)06-0605-06

10.3724/SP.J.1141.2011.06605

2011-10-24；接受日期：2011-11-14

武漢市學科帶頭人項目(201051730561)

?通訊作者(Corresponding author)，E-mail: miaowei@ihb.ac.cn; miaowei530@yeah.net