香魚凝血因子X基因表達與鰻利斯頓氏菌感染的相關性

黃左安, 陳 炯, 陸新江, 史雨紅, 李明云

(寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實室, 浙江 寧波 315211)

香魚凝血因子X基因表達與鰻利斯頓氏菌感染的相關性

黃左安, 陳 炯*, 陸新江, 史雨紅, 李明云

(寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實室, 浙江 寧波 315211)

凝血途徑的關鍵因子——凝血因子X (coagulation factor X, FX), 是一種與免疫調控密切相關的維生素K依賴型絲氨酸蛋白酶。該研究克隆了香魚 (Plecoglossus altivelis) FX基因全長cDNA序列, 它由1 817個核苷酸組成, 包含一個大的開放閱讀框, 編碼一個由453個氨基酸組成的相對分子質量為5.07 × 104的蛋白。香魚FX與已知的哺乳動物FX的結構相似, N端24個殘基為信號肽序列。序列比較表明, 香魚FX與斑馬魚FX的氨基酸同一性最高, 為53%。在健康香魚中, FX基因mRNA主要在肝組織中表達, 腦和鰓中也有少量表達。實時熒光定量PCR分析揭示, 鰻利斯頓氏菌感染后香魚肝組織中FX基因mRNA表達顯著上調, 16 h時達到5.43倍。通過原核表達系統表達了香魚FX絲氨酸蛋白酶結構域, 并制備了抗血清。Western blotting分析顯示, 鰻利斯頓氏菌感染后香魚血清中FX含量顯著增加, 并隨著時間延長上調倍數不斷增大, 在36 h時達到3.68倍。據此, FX基因mRNA及蛋白的表達與鰻利斯頓氏菌感染香魚的過程緊密相關, 揭示它可能在魚類抗細菌感染的免疫反應中起重要作用。

凝血因子X; 香魚; 鰻利斯頓氏菌; 實時熒光定量PCR; Western blotting

凝血因子X (coagulation factor X, FX) 是動物內源性和外源性凝血途徑共同通路的關鍵酶(Krupiczojc et al, 2008)。在機體受傷出血時, FX被激活轉變為FXa, 能與FVa、Ca2+、磷脂共同作用將凝血酶原轉化為凝血酶, 從而發揮凝血效應(Borensztajn et al, 2008)。此外, FX在免疫方面發揮著非常重要的作用。FXa能激活蛋白酶激活受體-1 (PAR-1)和蛋白酶激活受體-2 (PAR-2), 參與免疫調控維持機體免受病原體侵害 (Schoenmakers et al, 2005; Borensztajn & Spek, 2011); FXa能誘導人臍靜脈內皮細胞白介素-6 (IL-6) 和促炎細胞因子巨噬細胞遷移抑制因子(MIF) 的表達, 與炎癥反應相關(Cirino et al, 1997; Papapetropoulos et al, 1998; Shimizu et al, 2004); FX參與補體系統功能中心C3的激活, 從而參與補體系統涉及的免疫過程(Amara et al, 2008)。近年來, 哺乳類、鳥類、爬行類、魚類等多個物種的 FX基因序列已被測定(Pendurthi et al, 1997; Heidtmann & Kontermann, 1998; St Pierre et al, 2005; Kimura et al, 2009; Jima et al, 2009; Leong et al, 2010)。

香魚 (Plecoglossus altivelis) 隸屬胡瓜魚目香魚科, 是東亞地區中國、日本和朝鮮等國家特有的一種小型經濟名貴魚類。高密度人工養殖導致病害頻繁發生, 其中鰻利斯頓氏菌 (Listonella anguillarum) 是養殖香魚的主要病原菌之一, 造成巨大的經濟損失 (Li et al, 2009)。人工養殖香魚以無污染和綠色健康為特色, 抗生素和農藥防治病害受到諸多限制。因此, 迫切需要深入研究香魚免疫相關基因來指導香魚病害防治 (Uenobe et al, 2007; Chen et al, 2008)。由于FX基因在動物免疫反應中起重要作用, 我們擬對其進行研究。本實驗通過文庫隨機測序結合cDNA末端快速擴增 (RACE)的方法成功獲得香魚FX基因的cDNA 全序列, 明確了它的序列特征、系統進化關系和 mRNA 的組織表達特征, 并原核表達制備了抗血清, 隨后分別用實時熒光定量PCR (RT-qPCR) 和Western blotting研究了鰻利斯頓氏菌侵染后香魚肝組織 FX基因mRNA和血清FX蛋白的表達變化, 為進一步深入研究FX 在魚類抗細菌免疫中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

健康香魚個體體重 20～25g, 購自寧波水產大世界。大腸桿菌TG1菌株和載體pBluescript SKII (+)由本實驗室保存。RNAiso試劑、Oligotex-d T30＜super＞ mRNA Purification Kit、AMV逆轉錄酶、Ex TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、cDNA Library Construction Kit和SYBRPremixEx Taq試劑盒均購自 Takara公司; Gel Extraction Kit購自Omega公司; 引物合成及序列測定由上海英駿生物工程公司完成; 二抗 (辣根酶標記山羊抗小鼠 IgG)購自北京中山金橋生物技術有限公司; ECL化學發光試劑盒、顯影定影試劑盒、柯達X-OMAT BT膠片和壓片暗盒購自碧云天生物技術研究所。ICR小鼠購自寧波大學醫學院實驗動物中心。鰻利斯頓氏菌香魚分離株ayu-H080701由本實驗室保存。

1.2 香魚FX基因cDNA序列的獲得

提取健康香魚肝臟總 RNA, 經 1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性, 紫外分光光度計進行純度分析。用Oligotex-dT30純化mRNA, 以其為模板, 采用cDNA Library Construction Kit構建香魚肝cDNA文庫, 具體方法參照廠家說明。隨機挑取287個插入片段≥800 bp 的克隆進行序列測定。將獲得的cDNA序列通過 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)與 GenBank中的序列進行比較分析,篩選與已知物種 FX基因相似的部分序列, 并用RACE技術獲得香魚FX全長cDNA序列。

1.3 序列分析

信號肽序列預測采用 SignalP 3.0系統 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 多重序列比對采用ClustalW程序 (http://clustalw.ddbj.nig. ac.jp/), 系統進化樹構建采用MEGA 4.0 (Tamura et al, 2007)。

1.4 香魚FX基因mRNA的組織表達特征分析

采用RNAiso試劑提取香魚各組織總RNA, 并用DNase I (RNase-free) 進行處理。取1 μg總RNA為模板, oligo (dT)30為引物, 用AMV逆轉錄酶在42 ℃作用1.5 h, 合成第一鏈cDNA。根據已獲得的香魚 FX基因 cDNA序列設計引物, FXtest (+): 5′-CCACCCACTTCAAAGTATGCC-3′和FXtest (-):5′-TGACATGGGTGAGAGCAGCA-3′, 預期擴增片段長度為386 bp; 根據香魚看家基因β-actin cDNA序列(AB020884) 設計引物, pActin2 (+): 5′-TCGTGCGT GACATCAAGGAG-3′和pActin2 (-): 5′-CGCACTTC ATGATGCTGTTG-3′, 預期擴增片段長度為231 bp。PCR反應體系為25 μL, 包括cDNA 模板0.5 μL, 10× Ex PCR 緩沖液2.5 μL, dNTP混合物 (各2.5 mmol/L) 2 μL, 正向和反向引物 (10 μmol/L) 各1 μL, Ex Taq DNA 聚合酶(5U/μL) 0.25 μL 和滅菌水17.75 μL。PCR 反應條件為: 94 ℃預變性；2 min 后按下列程序進行30個循環, 每個循環包括94 ℃變性30 s, 58 ℃ 退火30 s, 72 ℃延伸30 s；循環結束后72 ℃延伸10 min。PCR產物用2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 鰻利斯頓氏菌侵染的香魚肝 FX基因 mRNA表達變化

取鰻利斯頓氏菌感染后不同時間香魚肝組織,檢測FX基因mRNA轉錄水平的變化。參照RNAiso操作說明書, 對每組的5條香魚肝組織總RNA進行提取, 并將同一組的 RNA進行等量混合。第一鏈cDNA合成, RT-qPCR的引物序列同1.4。25 μL PCR的反應體系包括SYBRPremix Ex Taq(2×) 緩沖液12.5 μL、引物各1 μL、模板0.5 μL、滅菌水10 μL。擴增反應在Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀上進行, 程序為94 ℃ 180 s (1個循環), 隨后進入擴增階段, 共40個循環, 每一循環包括: 94 ℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72 ℃ 30 s。為確保特異性擴增, PCR結束后對擴增產物進行熔解曲線分析, 條件是94 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 95 ℃ 30 s (1個循環)。為保證PCR結果的準確性, 每一個樣品重復分析 3次, 包括目標基因 (FX)和看家基因 (β-actin)。熒光定量的結果采用儀器自帶程序 MxPro 3.2讀取。根據 Livak & Schmittgen (2001)提出的相對標準曲線法2-ΔΔCt對相對定量的結果進行分析, 獲得香魚肝組織 FX基因mRNA的相對表達量。

1.6 香魚FX的原核表達和抗血清制備

由于香魚FX全長基因在pET28a、pET22b、pET15b、pSBET等載體中均不表達。因此, 我們選擇性表達香魚FX絲氨酸蛋白酶結構域。設計引物對 pET-FX (+): 5′-CCATATGATCCAAATCCATAAG ATCTATAT-3′和pET-FX (-): 5′-GGGATCCTCAAGG TTGGGGATAAACAGCA-3′ (下劃線為添加的限制性內切酶NdeI和BamH I的識別序列), 以cDNA為模板PCR擴增獲得目的片段, 擴增產物經1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離后, 用QIAquick Gel Extraction純化。純化產物用NdeI和BamH I雙酶切后, 插入到同樣雙酶切的原核表達載體 pSBET中, 獲得重組質粒pSBET-FX。pSBET-FX轉化大腸桿菌BL21 pLys E菌株, IPTG 誘導表達, 細菌裂解產物經SDS-PAGE電泳分離, 考馬斯亮藍G-250染色檢測表達情況。

重組菌體大量誘導后, 經 12% SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE兩次分離, 用0.25 mol/L KCl染色后, 切下目的條帶用以免疫小鼠。共免疫3次, 每次間隔一周。于第3次免疫后的第3天眼動脈取血, 4 ℃靜置4 h以上, 冷凍離心后取上清, 分裝后保存于-70 ℃備用。

1.7 Western blotting檢測

香魚尾靜脈抽取血漿后于4 ℃靜置4 h, 冷凍離心取上清, 將上清樣品用 Bradford法定量(Bradford, 1976)。0 h對照、4、8、12、16、24和36 h的血清蛋白樣品經5%濃縮膠 (100 V, 1 h) 和12%分離膠 (130 V, 2 h) 電泳, 將凝膠放置于等面積的已潤濕的 NC膜上, 然后夾在濾紙中, 濾紙上下各三層, 濕轉法35 V轉移3 h。轉膜結束后, 用10%脫脂奶粉的 PBS-T 37 ℃封閉 2 h。隨后一抗4 ℃孵育過夜, 一抗用 5%BSA和 0.02%疊氮鈉的PBS-T稀釋。一抗結束后, 將NC膜用PBS-T 15 min洗一次, 5 min三次。然后加入相應的辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG (用PBS-T 1∶5 000稀釋), 37 ℃溫浴1 h。再用PBS-T 15 min洗一次, 5 min四次, 加上ECL于暗室顯影。條帶用Quantity One軟件進行灰度值計算。

2 結 果

2.1 香魚FX基因cDNA序列分析

287 個隨機挑選的克隆中共篩選到 8個陽性克隆, 經測序分析, 與已知其他動物 FX基因具有較高的同源性, 且這些序列彼此間同源性＞99%。隨即用RACE方法獲得了香魚FX基因全長cDNA序列 (EMBL登錄號: FR851398)。 它由1 817個核苷酸組成, 3′-末端具有poly(A) 尾, 含一個大的開放閱讀框, 起始于第234～236 位的ATG起始密碼子, 終止于第1 593～1 595位的TGA終止密碼子, 推測編碼一個由 453個氨基酸組成、相對分子質量為 5.07 × 104的蛋白。分析表明,序列的3′-端非編碼區長222個核苷酸, 多腺苷酸化信號序列“AATAAA”位于第1 801～1 806位 (圖1)。香魚FX的N端24個氨基酸為信號肽序列, 其氨基酸序列還包括γ-羧基谷氨酸結構域 (Ala 43～Val 88)、兩個EGF-like結構域 (Asp 89～Glu 125、Ser 129～Cys 167) 和絲氨酸蛋白酶結構域 (Glu 190～Lys 437) 三種保守的結構域, 其中γ-羧基谷氨酸結構域中包含10個保守的γ-羧基谷氨酸。

全長氨基酸序列比較表明, 香魚 FX與斑馬魚FX同一性最高, 為53%, 與大西洋鮭FX的同一性為48%, 而與哺乳動物FX的同一性為44%～46%。系統進化樹分析表明, 魚類、哺乳動物、鳥類和爬行類FX分別成簇 (圖2)。

圖1 香魚FX基因cDNA核苷酸序列和預測的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequences of ayu FX cDNA and deduced amino acid sequences

圖2 基于NJ法構建香魚和其它動物全長FX蛋白氨基酸序列的系統進化樹Fig. 2 FX phylogenetic tree of ayu and other animals based on NJ method

2.2 香魚FX基因mRNA的組織表達特征

取健康香魚肝、脾、腎、腦、心、鰓、肌肉和腸進行RT-PCR檢測, FX擴增產物為386 bp, 內參β-actin為231 bp。RT-PCR結果表明, 健康香魚FX基因mRNA主要在肝中表達, 在腦和鰓中也有微量表達 (圖3)。

2.3 鰻利斯頓氏菌侵染前后香魚 FX基因 mRNA的表達變化

鰻利斯頓氏菌感染的香魚呈現出肌肉腐爛, 腸道、鰓蓋和魚鰭基部充血發紅等典型的細菌敗血癥癥狀, 而對照香魚 (注射生理鹽水) 未表現出任何異常現象。由于香魚FX基因mRNA主要在肝中表達。因此, 我們選取鰻利斯頓氏菌感染香魚4、8、12、16、24和36 h的肝組織, 進行RT-qPCR分析。結果表明, 與對照組相比, 4 h時, 染病香魚FX基因mRNA的表達量無明顯變化; 8 h后, 表達量顯著增加 (P＜0.05); 16 h時, 表達量達到峰值 (P＜0.05),約為對照組的5.43倍(圖4)（ANOVA,t-test）。

圖3 香魚FX基因mRNA的組織表達特征Fig.3 The mRNA expression patterns of ayu FX

圖4 利斯頓氏菌感染前后香魚肝組織中FX基因mRNA的表達變化Fig. 4 Analysis of liver FX mRNA expression changes post L anguillarum infection in ayu.

2.4 香魚FX基因絲氨酸蛋白酶結構域的原核表達

原核表達質粒 pSBET-FX經測序驗證無誤后,在大腸桿菌 BL21 pLys E中經 IPTG誘導表達, SDS-PAGE分離菌體蛋白, 出現一條高表達的誘導蛋白帶, 相對分子質量為2.3×104左右 (圖5 a), 與預測的香魚 FX絲氨酸蛋白酶結構域相對分子質量大小 (2.26×104) 相符。該片段切膠純化后免疫小鼠,制備抗血清。

圖 5 香魚 FX絲氨酸蛋白酶結構域原核表達和 Western blotting分析Fig. 5 Prokaryotic expression and Western blotting analysis of serine proteinase domain of FX

2.5 Western blotting檢測香魚血清中FX的含量變化

取4、8、12、16、24、36 h和對照香魚血清蛋白進行Western blotting分析, 在血清中檢測到相對分子質量為4.81×104的條帶(圖5 b)。與健康對照相比, 4 h時, 鰻利斯頓氏菌侵染的香魚血清中FX的含量未發生明顯變化; 8 h后含量顯著增加(P＜0.05), 并隨著感染時間延長含量持續增加, 8 h時為對照組的2倍, 36 h時為對照組的3.68倍 (圖6)。

3 討 論

FX廣泛存在于脊椎動物中。本實驗通過文庫隨機測序結合RACE的方法, 成功獲得了香魚FX基因cDNA全長序列, 這是香魚FX基因cDNA 序列的首次報道。推測的編碼蛋白具有γ-羧基谷氨酸結構域、EGF-like 結構域和絲氨酸蛋白酶等動物FX特征性結構域, 它與其它物種的氨基酸同一性小于53%。香魚FX基因mRNA主要在肝組織中表達, 這與哺乳類等物種的報道結果一致 (Pendurthi et al, 1997; Heidtmann & Kontermann, 1998; Borensztajn et al, 2008)。氨基酸序列系統進化樹分析揭示, 香魚FX 與斑馬魚FX的進化相關性最高,且與其它物種FX的進化關系與動物本身的進化分類相吻合, 揭示了FX在進化過程中的保守性。

圖6 香魚血清FX Western blotting檢測Fig. 6 Western blotting analysis of ayu serum

鰻利斯頓氏菌是養殖香魚出血性敗血癥的主要病原之一, 由其引起的病害給香魚產業造成了巨大的經濟損失 (Li et al, 2009)。本實驗研究表明, FX基因的mRNA表達及血清中FX的蛋白含量變化均與鰻利斯頓氏菌侵染香魚的過程緊密相關, 這在魚類中是首次報道, 揭示了 FX很可能在魚類抗細菌侵染的免疫反應中起作用。結合前人對哺乳動物FX的研究結果, 我們推測魚類 FX在此病程中的作用如下: 1) FX作為動物內源性和外源性凝血途徑共同通路的關鍵酶 (Krupiczojc et al, 2008), 首要功能是促進凝血 (Borensztajn et al，2008)。細菌感染的急性期反應特征之一是病原菌感染宿主動物后短時間內, 宿主血液中的纖維蛋白原在凝血酶的作用下迅速形成纖維蛋白, 并于炎癥區組織間隙構成網狀物或凝塊, 以阻止病原菌及其毒性產物的擴散。因此, FX的表達上調可能起促進凝血, 緩解病情的作用。我們之前對香魚抗凝血酶 (antithrombin, AT)基因的研究也表明, 到12 h時, 細菌侵染組香魚的肝AT基因mRNA表達與健康組相比顯著下調 (Li et al, 2011), 已知AT和FX的作用相互拮抗。因此,我們認為侵染前期FX基因mRNA的表達上調與AT基因mRNA的表達下調的目的是一致的, 均有利于凝血系統發揮作用。有意思的是, 兩個基因mRNA的表達均在16 h時顯著增加, 這可能是由于凝血和纖溶系統過度激活容易導致彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)而給機體造成嚴重損傷。因此, 在 FX顯著上調的同時, AT也從前期的表達下調轉變為顯著上調, 兩者的作用相互拮抗, 以避免凝血系統的過度激活。2) 哺乳動物研究發現, FXa能誘導人臍靜脈內皮細胞IL-6和MIF的表達 (Cirino et al, 1997; Papapetropo ulos et al, 1998; Shimizu et al, 2004 ); 或參與激活補體系統C3 (Amara et al, 2008)。一些魚類研究也表明病原菌感染后, IL-6、C3和MIF的表達量均上調 (Bird et al, 2005; Chen et al, 2008; Wang, 2010), 我們抑制消減雜交的結果也表明鰻利斯頓氏菌侵染8 h后, 香魚肝組織中補體系統成分, 如 C4、C5、C8、C9、Cfh、Cfb等基因 mRNA均顯著表達上調 (結果未發表)。然而,魚類 FX是否介導病原菌感染后上述細胞因子及補體系統成分的表達增加尚有待于進一步證明。

綜上所述, 本研究首次報道了魚類凝血因子 X基因表達與鰻利斯頓氏菌感染的相關性, 為魚類FX的結構、功能和作用機制的深入研究奠定了基礎。

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Alteration on the expression of ayu coagulation factor X gene uponListonella anguillaruminfection

HUANG Zuo-An, CHEN Jiong*, LU Xin-Jiang, SHI Yu-Hong, LI Ming-Yun

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology,Ministry of Education,Ningbo University,Ningbo, 315211China)

Coagulation factor X (FX) plays an important role in the immune response of mammals. In this study, the full length cDNA sequence of the ayu FX gene, 1817 bp in length excluding 3'-polyA tail, was determined for the first time. The sequence contained an open reading frame, which encoded a protein of 453 amino acids with a molecular weight of 5.07 × 104. The predicted protein had motifs typical of animal FX, and its N-terminal 24 residues were the signal peptides. Sequence comparison showed that ayu FX shared 53% amino acid sequence identity with zebrafish FX. In healthy ayu, FX mRNA was expressed mainly in the liver and weakly in the brain and gill. AfterListonella anguillaruminfection, liver FX transcriptions significantly increased, and peaked at 16 h post infection. The serine protease motif of ayu FX was expressed inEscherichia coliand was subsequently used for antiserum preparation. Western blotting analysis revealed that serum FX significantly increased in bacterially infected ayu fish. In conclusion, the ayu FX gene expression was significant in the progress of bacterial infection, which suggests FX’s role in fish immune response.

Coagulation factor FX; Ayu;Listonella anguillarum; RT-qPCR; Western blotting

Q917.4; Q959.499

A

0254-5853-(2011)05-0492-07

D OI: 10.3724/SP.J.1141.2011.05492

2011-05-09; 接受日期:2011-07-08

長江學者和創新團隊發展計劃項目(IRT0734); 教育部新世紀優秀人才支持計劃項目(NCET-08-0928); 寧波市自然科學基金項目(2010A610001)

?通訊作者(Corresponding author), Tel: 0574-87609571, E-mail: jchen1975@163.com

黃左安(1988—), 男, 浙江溫州人, 碩士生, 研究方向:水產分子生物學; Tel: 13958231636; E-mail: hzaok@163.com