蚯蚓金屬硫蛋白定量PCR檢測方法及其分子診斷

陳 春,周啟星 (1.南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點實驗室,天津 300071；2.農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所,天津 300191)

蚯蚓金屬硫蛋白定量PCR檢測方法及其分子診斷

陳 春1,2,周啟星1*(1.南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點實驗室,天津 300071；2.農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所,天津 300191)

根據(jù)GenBank中蚯蚓(Eisenia fetida)金屬硫蛋白(MT)基因序列設(shè)計合成引物,采用RT-PCR擴增出目的基因片段,將目的基因片段插入pEASY-Blunt中制備質(zhì)粒標準品.通過不同梯度稀釋倍數(shù)的質(zhì)粒標準品,建立了目的基因MT與內(nèi)參基因β-actin的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法.通過土壤染毒培養(yǎng)實驗,將蚯蚓分別暴露于50,500,1000mg/kg 重金屬Cd染毒的自然土壤中培養(yǎng)14,28d,研究蚯蚓體內(nèi)MT mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達變化.結(jié)果表明,重組質(zhì)粒測序后顯示目的片段序列同源性好,證明所設(shè)計的MT、β-actin引物能成功用于蚯蚓MT mRNA的檢測.兩基因構(gòu)建的熒光定量標準曲線線性關(guān)系分別為0.994,0.999,且PCR擴增效率也皆接近于100%.染毒實驗發(fā)現(xiàn),Cd可誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)MT mRNA的表達,其表達水平與Cd污染暴露呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系,表明蚯蚓MT基因可作為潛在分子標志物,診斷環(huán)境中Cd污染及其暴露水平.

金屬硫蛋白；蚯蚓；熒光定量RT-PCR；鎘；分子標志物

金屬硫蛋白(MT)是一類普遍存在于生物體內(nèi)的低分子量(6～7kDa)、富含半胱氨酸、熱穩(wěn)定性、可誘導(dǎo)型非酶蛋白,它能廣泛地被重金屬、電離輻射、化學(xué)藥品、激素、應(yīng)激激素等多種因素誘導(dǎo)表達合成[1-2].從生態(tài)系統(tǒng)角度來看,蚯蚓是陸生生物與土壤介質(zhì)之間信息傳遞的橋梁,它具有直接與土壤或化學(xué)污染物暴露相接觸的優(yōu)越性[3].因此,蚯蚓通常作為陸地生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域中的優(yōu)先指示物種,用來指示土壤中重金屬等有毒物質(zhì)的污染狀況[4].國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)[5],某些重金屬可誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)MT的特異性表達,推薦MT作為潛在的新型生物標志物,用來評價重金屬對土壤生態(tài)系統(tǒng)的生物效應(yīng).而國內(nèi)的相關(guān)研究還僅局限于使用傳統(tǒng)方法檢測MT的表達水平,如分光光度計法檢測重金屬脅迫下蚯蚓體內(nèi) MT粗蛋白含量[6].近年來,隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,一些檢測與評價環(huán)境的有效方法相繼建立和發(fā)展起來.熒光定量RT-PCR技術(shù)作為一種核酸定量的手段,以其特異性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好、全封閉反應(yīng)等特點,被廣泛用于環(huán)境分子生物標志物檢測以及分子生態(tài)毒理學(xué)等諸多領(lǐng)域[7].

本實驗使用 SYBR Green I熒光定量RT-PCR技術(shù),建立了MT基因在轉(zhuǎn)錄水平上的檢測方法,并結(jié)合土壤染毒模擬試驗,研究蚯蚓MT基因表達水平在重金屬Cd暴露脅迫下的變化規(guī)律,以期為今后應(yīng)用MT作為分子生物標志物診斷環(huán)境中 Cd污染狀況,提供方法基礎(chǔ)和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

選擇具有明顯生殖環(huán)帶(2～3個月齡)、體重為 400～450mg、已馴化的赤子愛勝蚓(Eisenia fetida)為供試物種.供試污染物 CdCl2·2.5H2O為分析純.

土壤采自天津塘沽森林公園,為 0～20cm表層潔凈自然土壤.

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓MT基因的SYBR Green I定量PCR檢測 Trizol法提取蚯蚓總RNA.總RNA經(jīng)RQ1 RNase-Free DNase (Promega,美國)處理純化后,取 1μg總 RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄酶 ReverTra Ace (Toyobo,日本)合成DNA.根據(jù)GenBank發(fā)表的蚯蚓 MT序列(登錄號 AJ236886)[8],設(shè)計擴增 MT基因片段的引物,其上游引物:5’-TGTGCTGACGCTGAGAAG-3’;下游引物:5’-TGATGACA GAGTTCCGTAT-3’.內(nèi)參基因 β-actin引物設(shè)計參照 Brulle[9],上游引物:5’-CAAGCAGGAGTACGATG-3’;下游引物:5’-TCCGCAAGCTGAGCAT-3’,由上海生工合成.

取cDNA 2μL,上下游引物各1.5μL,10mmol/L dNTPs 1μL,25mmol/L MgSO43μL, KOD-plus-1μL,10×PCR Buffer 5μL,ddH2O35μL,反應(yīng)總體積50μL.94℃預(yù)變性2min;98℃變性10s, 55℃退火30s,68℃延伸 30s,35個循環(huán);68℃延伸 10min. PCR產(chǎn)物采用凝膠回收試劑盒(Axygen,美國)純化后,連接至平末端載體pEASY-Blunt (全式金,北京),再轉(zhuǎn)化至top10感受態(tài)細胞上,挑取重組成功的菌落進行PCR初步鑒定,將篩選出的陽性菌落進行培養(yǎng),質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen,美國)抽提、純化質(zhì)粒.用DEPC處理后的ddH2O將重組的MT、β-actin質(zhì)粒10倍系列稀釋后,作為熒光定量標準品-20℃保存.同時任選3個重組質(zhì)粒進行雙酶切和測序分析(測序由北京華大基因公司完成).采用NCBI中Blast程序進行同源性比較.

熒光定量PCR擴增體系為20μL,其中SYBR Green I Master Mix(Bio-rad,美國) 10μL, ddH2O 6.4μL,上下游引物(10μmmol/L)各 0.8μL,模板質(zhì)粒 DNA 2.0μL.反應(yīng)條件是 95℃預(yù)變性 2min, 95℃變性15s,55℃退火30s,72℃延伸采集熒光信號30s,45個循環(huán).定量PCR反應(yīng)結(jié)束后熔解曲線分析:95℃ 1min;60℃ 1min,60℃ 30s后,0.5℃/s (溫度每秒遞升0.5℃),直至95℃結(jié)束.

分別制備 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷貝數(shù)/μL等梯度濃度的 MT和 β-actin標準質(zhì)粒,然后進行定量PCR擴增,檢測熒光定量PCR的靈敏度.此外,為了驗證檢測方法的重復(fù)性,重復(fù)制備 1×103、1×104、1×105、1×106、1×107拷貝數(shù)/μL標準品5次,熒光定量PCR擴增后分別得到Ct值,計算出每個濃度標準品的5次Ct值之間的變異系數(shù). 1.2.2 重金屬Cd誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)MT在轉(zhuǎn)錄水平的表達 經(jīng)自然風(fēng)干后的土壤樣品過篩(粒徑＜2mm),其土壤理化性質(zhì)為:顆粒組成為 47.4%黏粒,38.4%粉粒,14.6%沙粒;有機質(zhì)含量為4.2%;陽離子交換量是 20.35cmol/kg;pH7.2.鑒于農(nóng)田土壤Cd背景值為0.15～8.23mg/kg[10]和蚯蚓的半致死濃度LC50[11],分別配制50,500,1000mg/kg的Cd濃度(以CdCl2·2.5H2O濃度計)溶液,與土壤(500g)混合均勻穩(wěn)定7d后,調(diào)節(jié)土壤水分含量為最大持水量的60%.每個處理和對照分別加入10條蚯蚓,各重復(fù)4次.污染暴露14和28d后,采用相對定量方法分析蚯蚓體內(nèi)MT mRNA的表達水平[12].數(shù)據(jù)處理使用 SPSS13.0軟件單因素方差分析

(ANOVA),多重比較采用 Dunnett’s,與對照比較時P＜0.01為顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 蚯蚓MT基因熒光定量方法的建立與驗證

2.1.1 提取的蚯蚓總RNA純度和完整性 蚯蚓總RNA的A260/A280為1.92,表明Trizol法提取出的總 RNA純度較高.此外,瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明RNA條帶完整,無降解(圖1).

圖1 蚯蚓總RNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis image of total RNA from earthworm

2.1.2 RT-PCR產(chǎn)物鑒定、克隆、測序 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后,初步推測兩基因片段大小皆為160bp左右(圖略),但仍需通過克隆、酶切及測序等驗證其是否為目標基因.挑取克隆單菌落進行PCR反應(yīng),1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示,克隆單菌落均含可能含有目的基因片段.然后各選取典型的3個克隆單菌落提取質(zhì)粒.

MT、β-actin重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I、BstX I雙酶切后,均分別獲得與目的片段長度相近的條帶(含有部分載體克隆位點序列)(圖 3),表明所檢測的單克隆菌落均為陽性,重組子都含有目的片段,且片段已連接至載體上.然后分別將3個MT、β-actin重組質(zhì)粒進行測序.

圖2 MT基因與β-actin基因菌落PCR電泳圖Fig.2 Electrophoresis image of colony PCR product of MT and β-actin

圖3 MT基因與β-actin基因質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.3 The identification of restrictive enzymes digestion of plasmids MT and β-actin

經(jīng)測序發(fā)現(xiàn),3個MT基因重組質(zhì)粒DNA片段相同.其序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast程序比對證實,與 GenBank中已收錄的蚯蚓 MT序列(AJ236886)相似性為100%,表明本實驗所設(shè)計的引物可成功擴增蚯蚓體內(nèi)MT基因.3個β-actin重組質(zhì)粒的測序結(jié)果皆相同,與GenBank中已有的蚯蚓 β-actin序列(DQ286722)比對基本一致,也表明設(shè)計的引物符合實驗要求.

2.1.3 熒光定量PCR方法的靈敏度與重復(fù)性分析 選取1×102～1×109拷貝數(shù)/μL的MT重組質(zhì)粒作為定量PCR模板,擴增曲線見圖4a.同時,擴增產(chǎn)物熔解曲線顯示目的產(chǎn)物具特異的單個峰(圖5a),說明以上各稀釋度的模板,定量PCR均可擴增出特異性產(chǎn)物.質(zhì)粒濃度在 1×103～1×109拷貝數(shù)/μL范圍內(nèi)時,模板拷貝數(shù)的對數(shù)與相應(yīng)的擴增反應(yīng)Ct值呈線性關(guān)系,R2達到0.994,擴增效率E為100.5%,標準曲線回歸方程為y=-3.311x+ 38.565,其中y為Ct值,x為MT基因質(zhì)粒的拷貝數(shù)對數(shù)(圖 6a).當(dāng)質(zhì)粒最低濃度為 1×102拷貝數(shù)/μL時,反應(yīng)也可擴增出特異性目的條帶,但對應(yīng)Ct值與其他高濃度時的Ct值間的線性關(guān)系稍差.

圖4 MT基因、β-actin基因熒光定量PCR擴增動力學(xué)曲線Fig.4 The kinetic curve of real-time quantitative PCR amplification of MT and β-actin

內(nèi)參基因 β-actin定量 PCR擴增曲線如圖4b,熔解曲線見圖 5b.結(jié)果表明,β-actin質(zhì)粒濃度為1×102～1×109拷貝數(shù)/μL時,均可擴增出特異性目的產(chǎn)物.且質(zhì)粒濃度為1×103～1×108拷貝數(shù)/μL范圍內(nèi)時,模板拷貝數(shù)的對數(shù)與相應(yīng)的Ct值呈線性關(guān)系,R2高達0.999,擴增效率為99.4%,標準曲線回歸方程為y = -3.337x+ 37.667(圖6b).

5組標準品平行(濃度為1×103～1×107拷貝數(shù)/μL)熒光定量PCR結(jié)果如表1,其重復(fù)樣品間的變異系數(shù)分別為1.13%、1.81%、1.51%、1.24%、 2.01%.表明 5組標準品間檢測方法的重現(xiàn)性好,試驗結(jié)果是穩(wěn)定可靠的.

圖5 MT基因、β-actin基因的熔解曲線分析Fig.5 The melt curve analysis of MT and β-actin

2.2 重金屬Cd對蚯蚓MT轉(zhuǎn)錄水平表達的影響

由圖7可知,空白對照組中蚯蚓體內(nèi)MT基因表達水平幾乎沒有變化.與對照組比較,暴露于不同濃度Cd中蚯蚓體內(nèi)MT mRNA的表達水平極顯著性上調(diào)(P＜0.01).且隨著 Cd濃度的增加,蚯蚓MT mRNA的表達水平也隨之升高.即Cd染毒暴露 14d時,50和500mg/kg Cd處理組的MT mRNA表達水平分別是對照組的12.6倍和14.8倍,1000mg/kg Cd處理組的MT mRNA表達水平較對照組高達26.8倍.結(jié)果還顯示,隨著Cd暴露時間的延長,同一濃度組的MT mRNA表達水平也隨之升高.即50,500mg/kg Cd染毒28d后,與14d處理組相比較MT mRNA表達水平皆有升高,且分別是對照組的16.1倍和20.0倍.另外與其他濃度處理組相比較,1000mg/kg Cd暴露28d的處理組MT mRNA誘導(dǎo)水平最高,是對照組的36.8倍.

圖6 MT基因、β-actin基因的標準曲線Fig.6 The standard curve of MT and β-actin

表1 MT基因標準品Ct值檢測的重復(fù)性驗證Table 1 Reproducibility evaluation on the Ct value of MT plasmid standards

3 討論

MT普遍存在于各種生物體中[13-14],尤其以肝臟和腎臟中含量最為豐富,它能廣泛地被重金屬、激素、以及其他環(huán)境因素誘導(dǎo)表達合成.土壤生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域中,蚯蚓通常作為主要的指示物種,用來評價環(huán)境污染物的暴露水平.其中,Cd等重金屬可誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)MT基因的表達.因此,國外逐漸開展蚯蚓MT mRNA作為重金屬污染暴露下分子生物標志物的研究[9,15-16],但國內(nèi)研究尚屬空白.考慮到蚯蚓品種因地域性差異引起的其MT基因略有差別.本研究選用國內(nèi)蚯蚓品種赤子愛勝蚓作為供試物種,通過成功克隆 MT cDNA片段,建立蚯蚓MT基因的SYBR Green_I定量PCR檢測方法,并且分析了Cd暴露脅迫下MT基因轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢,從而探討 MT基因作為分子標志物表征Cd暴露水平的可行性.

圖7 重金屬Cd對蚯蚓體內(nèi)MT mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.7 Expression level of MT mRNA in earthworm exposed to Cd*表示同一暴露時間下處理組與對照比較差異極顯著(P＜0.01)

通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和篩選合適的引物等實驗前期工作,目的基因MT與內(nèi)參基因 β-actin的標準曲線線性關(guān)系分別為0.994、0.999,PCR擴增效率皆接近100%,熒光定量標準曲線均被成功構(gòu)建.通常,試驗樣本 RNA或cDNA濃度不同、樣本的保存與采取、RNA提取、反轉(zhuǎn)錄等過程均會導(dǎo)致mRNA拷貝數(shù)出現(xiàn)誤差.而通過管家基因β-actin作為內(nèi)參標準化MT基因mRNA拷貝數(shù),可以減少實驗誤差.本文成功構(gòu)建了蚯蚓MT基因質(zhì)粒,其質(zhì)粒DNA可作為MT基因絕對定量標準品使用,從而為檢測蚯蚓體內(nèi)MT基因的表達水平奠定了基礎(chǔ).而且目的MT與管家基因β-actin的擴增效率均接近于100%,且二者擴增效率之差遠小于 10%.故研究外界因素誘導(dǎo)蚯蚓 MT表達水平的時空變化水平時,可采用相對定量分析方法中的比較Ct法分析試驗數(shù)據(jù).本研究建立的蚯蚓 MT基因的SYBR Green I熒光定量PCR方法最低檢出限為1×102拷貝數(shù)/μL,且在其質(zhì)粒濃度為 1×103～1×109拷貝數(shù)/μL范圍內(nèi)具有良好檢測效果,檢測器幅度高達7個數(shù)量級,實驗重現(xiàn)性好.

此外,土壤實驗表明Cd污染脅迫下,蚯蚓MT mRNA的表達水平呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系.這說明蚯蚓MT基因可能作為潛在的分子標志物用來表征、評價土壤中Cd的污染暴露水平,這與多數(shù)國外學(xué)者的研究結(jié)果相一致. Brulle等[9]指出暴露于80,800mg/kg Cd污染的人工土壤中,蚯蚓 MT基因表達水平顯著升高. Svendsen等[14]的研究也發(fā)現(xiàn),暴露于重金屬污染的蚯蚓 MT-2基因表達水平和蚯蚓個體繁殖數(shù)目存在很好的線性關(guān)系,并強調(diào)MT-2轉(zhuǎn)錄水平的表達作為生物標志物可很好的監(jiān)控Cd為代表的重金屬污染水平.

本實驗建立了蚯蚓 MT基因的熒光定量RT-PCR檢測方法,并且開展了重金屬Cd脅迫下蚯蚓MT mRNA表達水平的研究.檢測方法的建立可為蚯蚓 MT基因轉(zhuǎn)錄水平的定量檢測與差異性的相對分析提供了有效的技術(shù)手段.本研究也為 MT基因作為潛在分子標志物指示環(huán)境中Cd的污染暴露水平提供了方法基礎(chǔ)和參考依據(jù).今后,關(guān)于重金屬微量持續(xù)污染對蚯蚓 MT mRNA的表達有何影響,尚有待于進一步的研究.

4 結(jié)語

經(jīng)測序與序列同源性分析表明,目的基因與已發(fā)表的蚯蚓 E. fetida相應(yīng)的功能基因序列同源性極高,達到預(yù)期克隆目的基因的要求.建立了MT、β-actin基因的熒光定量標準曲線,其線性關(guān)系均高于0.99, PCR擴增效率均接近于100%.Cd土壤染毒暴露下,蚯蚓體內(nèi)MT mRNA誘導(dǎo)表達水平與Cd濃度間存在劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系,其中 1000mg/kg Cd暴露 28d的處理組MT mRNA上調(diào)表達水平最高,是對照組的36.8倍.

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Quantitative real time PCR method for detection of metallothionein in Eisenia fetida and application of molecular diagnosis in cadmium exposure.

CHEN Chun1,2, ZHOU Qi-xing1*(1.Key Laboratory of Environmental Pollution Process and Criteria, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control, College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China; 2.Agro-Environmental Protection Institute of Ministry of Agriculture, Tianjin 300191, China). China Environmental Science, 2011,31(8)：1377～1382

The primers were designed based on previous reported sequence of metallothionein (MT) gene. Selected genes were amplified by RT-PCR and cloned into pEASY-Blunt vector to construct recombinant plasmid. Standard curves of target gene (MT) or reference gene (β-actin) were generated using serial dilution of recombinant plasmids cDNA. And the method of SYBR Green I real-time quantitative PCR was established for the detection of MT mRNA transcript level. Moreover, MT gene expression level was detected in Eisenia fetida after 14 and 28d of exposure to 50,500,1000mg/kg Cd. The results of sequence alignment showed that the sequences of cDNA fragments in recombinant plasmid were confirmed to be correct corresponding to previous known genes, which indicated that MT and β-actin cDNA fragments were cloned respectively. The liner correlation coefficient of two standard curves was 0.994 and 0.999, respectively and PCR amplification efficiencies were both close to 100%. Therefore, the real-time PCR detection of MT gene expression was sensitive, specific and reliable. Furthermore, the expression level of MT gene was significantly (P＜0.01) up-regulated in a dose-dependent and time-dependent manner. The highest (36.8-fold) up-regulation level was found in E. fetida after 28d of exposed to 1000mg/kg Cd compared to controls. These results suggested that MT may be applied as a molecular biomarker provide early warning signs for the stress of Cd exposue in future.

metallothionein；earthworm；quantitative real-time PCR；cadmium；molecular biomarker

X17

A

1000-6923(2011)08-1377-06

2011-01-26

國家自然科學(xué)基金資助項目(21037002);國家環(huán)保公益性項目(201009032)

* 責(zé)任作者, 教授, zhouqx@nankai.edu.cn

陳 春(1980-),男,安徽宿縣人,博士研究生,主要從事分子生態(tài)毒理學(xué)研究.發(fā)表論文10余篇.