硝化產物對硝化細菌混培物保藏特性的影響

汪彩華,鄭 平,胡安輝 (.浙江大學環境工程系,浙江 杭州 30029；2.北京天地人環保科技有限公司,北京0076)

硝化產物對硝化細菌混培物保藏特性的影響

汪彩華1,2,鄭 平1*,胡安輝1(1.浙江大學環境工程系,浙江 杭州 310029；2.北京天地人環保科技有限公司,北京100176)

采用添加硝化產物的方法,研究了饑餓保藏過程中硝化產物對硝化細菌混培物活性和相關性狀的影響.結果表明,饑餓保藏過程中添加亞硝酸鹽可改善硝化細菌混培物的保藏效果,并明顯降低硝化活性的衰減速率.缺氧條件下,4℃加5mmol/L亞硝態氮、4℃加5mmol/L硝態氮及4℃不加代謝產物3種保藏方法下的硝化活性均呈指數衰減,衰減速率分別為0.010d-1、0.020d-1、0.021d-1,半衰期分別為72.3、33.9、32.7d;硝化活性趨于穩定時,3種方法下的硝化活性保留率分別為18.7%、19.1%和15.1%,總菌體量保留率分別為62.0%、47.3%和58.7%;隨著饑餓保藏時間的延長,各方法下的硝化細菌混培物ATP含量和血紅素c含量均隨硝化活性的衰減而下降,混培物顏色也隨硝化活性的衰減而變黑.

硝化細菌混培物；硝化產物；保藏特性

硝化作用是多種生物脫氮技術的基礎,是氨經亞硝酸細菌氧化成亞硝酸,再經硝酸細菌氧化成硝酸的一個系列反應[1-2],除了涉及到氨、亞硝酸和硝酸等多種產物和基質外,還涉及到生物催化劑—硝化細菌.由于硝化裝置中基質氨濃度較高,硝化過程中常有亞硝酸和硝酸的積累,而當亞硝酸和硝酸積累到一定濃度時會對硝化細菌活性產生抑制作用[3-5].

而隨著廢水生物脫氮工程的普及,對高效硝化菌種的需求日益增大.但至今為此,國內對硝化細菌混培物保藏的研究還未見報道,國外也僅僅停留于研究低溫對硝化細菌混培物保藏的影響[6-8].亞硝酸鹽和硝酸鹽作為硝化作用的產物,積累到一定濃度會對硝化活性產生抑制作用,但若能在基質缺乏的工況下仍對硝化活性有抑制作用,卻變成了是一件幸事.因此,設計了在硝化細菌混培物保藏過程中加入硝化產物的試驗,以探究硝化產物亞硝態氮和硝態氮是否可以對硝化細菌混培物的饑餓狀況起到正調控作用,從而有助于硝化菌種的保藏和應用.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用硝化細菌混培物取自浙江某企業短程硝化池(總容積2.5m3),該短程硝化池采用模擬廢水(其成分詳見文獻[9])運行,并已在自然環境溫度下穩定運行一年半,混培物濃度為2～3gMLVSS/L,容積負荷達 1.5～2kg/(m·d),沉降比為15%.

1.2 保藏試驗

硝化細菌混培物用自來水洗滌 3次后自然沉降潷水,分別在3個1L的玻璃瓶(R1、R2、R3)中分裝800mL沉降潷水后的混培物和100mL模擬廢水,使 3個瓶中的最終氨氮濃度均為5mmol/L,混培物濃度均為 19.72gMLSS/L、13.48gMLVSS/L;再分別在 R1中另加入亞硝態氮,R2中加入硝態氮,使其終濃度均為 5mmol/L;最后將 3個玻璃瓶(R1、R2、R3)用鋁箔封口并置于 4℃冰箱中保藏,每隔 1個月取混培物測定活性和其他相關指標.模擬廢水成分為MgSO4· 7H2O 0.3g/L, KHCO32.0g/L, KH2PO40.01g/L, CaCl2·2H2O 0.0056g/L,微量元素Ⅰ、Ⅱ各1mL/L[2].

1.3 活性測定

活性測定所用的模擬廢水成分同上,氨氮濃度為50mg/L,pH值控制在7.7～7.8.每20mL模擬廢水中加入 2.5g濕硝化細菌混培物后曝氣2min使溶解氧達到飽和,再在 30℃下用溶解氧自動記錄儀記錄溶解氧的消耗情況,每隔 2s記錄一次,直至溶解氧降為0.5mg/L.另設不加基質的對照試驗,用同樣的方法測定硝化細菌混培物的耗氧速率.

1.4 測定項目與方法

SS、VSS(總菌體量)、SV30采用國標法[10]; COD采用EVOVI ET99718COD儀快速測定;pH值采用pHS－9V型酸度計測定;DO采用YSI 58型溶解氧儀測定(外接自動記錄儀);硫化物采用亞甲基藍分光光度法測定;硫酸鹽采用鉻酸鋇分光光度法測定.

ATP:熒光素酶法[11-12].取 1g濕硝化細菌混培物于2mL雙蒸水中制成菌懸液,再于沸水浴中煮1h的4.5mL提取劑(20mmol/L Tris、2mmol/L EDTA, pH值7.75)中加入0.5mL菌懸液,共同煮10min,冷卻后于10,000g、4℃下離心4min,取上清夜待用.25℃下,向2mL計數瓶中加入1mL緩沖液(0.05mol/L Tris-HAc、0.01mol/L MgSO4· 7H2O、2mmol/L EDTA,pH值7.75)后,再加入樣品提取液、熒光素和熒光素酶,混合后立即于熒光分光光度計中測定發光值.

血紅素:吡啶血紅素分光光度法.取 1g濕硝化細菌混培物懸浮于25mL 10mmol/L、pH值為7.5的磷酸緩沖液中,再于800W功率下超聲破碎20min,最后于 15,000g、4℃條件下離心 15min,取上清液進行測定,測定方法詳見文獻[13].

掃描電鏡觀察:取適量混培物樣品于2.5%戊二醛溶液中 4℃固定過夜,經 0.1mol/L pH值為7.0磷酸緩沖液洗滌3次后用1%鋨酸溶液固定1～2h, 接著用0.1mol/L pH 7.0磷酸緩沖液洗滌3次,再用梯度濃度乙醇(包括 50%、70%、80%、90%和 100%)進行脫水處理,脫水處理后的樣品用1:1乙醇醋酸異戊酯處理30min,用純醋酸異戊酯處理 1～2h.最后將樣品置于臨界點干燥,鍍膜后用XL30型環境樣品掃描電鏡(荷蘭Philips公司)觀察結果.

2 結果與分析

2.1 硝化產物對硝化活性和總菌體量的影響

2.1.1 硝化產物對硝化活性的影響 高濃度氨氮的硝化裝置中,當代謝產物亞硝態氮和硝態氮積累到一定濃度時會對硝化細菌活性產生抑制作用.添加不同代謝產物后硝化活性隨饑餓保藏時間的變化如圖1.

從圖 1可看出,在保藏過程中,硝化細菌混培物活性呈指數衰減,活性衰減速率和半衰期見表1.饑餓保藏120d后,各保藏方法的硝化活性均趨于穩定,R1(4℃加 5mmol/L亞硝態氮)、R2(4℃加 5mmol/L硝態氮)和 R3(4℃不加硝化產物)的活性保留率分別為 18.7%,19.1%和15.1%.雖然硝化活性趨于穩定時 3者表觀上顯示的活性保留率相差不多,但比較3者的半衰期發現,R1的半衰期遠遠長于R2和R3,分別是兩者的2.13倍和2.21倍,這一結果說明添加亞硝態氮可以暫時緩解硝化細菌混培物因饑餓所致的不利影響,但添加硝態氮的效果不明顯.亞硝態氮和硝態氮雖然同為硝化作用代謝產物,但在硝化細菌混培物的饑餓保藏過程中所起作用不同,饑餓保藏中加入亞硝態氮可明顯緩解硝化細菌的饑餓狀況,而加入硝態氮卻沒有這種效用.究其原因可能有:一是本試驗所用硝化細菌混培物取自短程硝化池,除了優勢菌——氨氧化細菌外還含有亞硝酸氧化細菌和反硝化細菌,在短程硝化工藝的長期馴化過程中反硝化細菌還原硝態氮的能力被慢慢弱化,相反還原亞硝態氮的能力卻被逐漸加強,保藏過程中加入的亞硝態氮可在亞硝酸鹽還原酶的作用下還原成NO[14-15],NO進一步轉化成NO2,缺氧條件下 NO2成為氨單加氧酶的共基質,從而發生厭氧氨氧化反應[16],而一般氨氧化細菌的厭氧氨氧化速率僅有好氧氨氧化速率的1/10[2],因此減少了硝化細菌對氨氮的需求量;二是某些氨氧化細菌胞內也含有亞硝酸鹽還原酶[12],同樣可以將亞硝態氮還原成NO而發生厭氧氨氧化反應.所以,在氨氮供應不足的情況下外加亞硝態氮可起正調控.

圖1 硝化活性隨保藏時間的變化Fig.1 The change of nitrifying activity during preservation

2.1.2 硝化產物對總菌體量的影響 隨著饑餓保藏時間的延長,硝化細菌混培物發生解體,菌體濃度逐漸下降,試驗中總菌體量隨保藏時間的變化如圖2所示.

表1 不同保藏方法下硝化活性衰減速率和半衰期Table 1 The decay rate and half-life of nitrifying activity under different preservation conditions

圖2 總菌體保留率隨保藏時間的變化量Fig.2 The change of total biomass during preservation

從圖2可知,在饑餓保藏過程中,總菌體保留率隨保藏時間的延長而減少,且前60d的衰減速率要明顯比后90d大.保藏的前60d, R1、R2、R3的總菌體量分別下降 22.6%、34.0%、31.8%,而后90d僅分別下降19.8%、22.3%、18.2%.保藏150d后,R1、R2和R3的總菌體量保留率分別為57.6%、42.7%和50.0%,但保藏過程中3者的總衰減速率始終為 R2＞R3＞R1.這一結果表明, 在硝化細菌混培物保藏過程中,加入亞硝態氮不僅可以減緩硝化活性的衰減,而且可以減緩菌體的衰減,但加入硝態氮的情況卻與此相反,原因有待深入研究.但可說明經饑餓保藏后存活下來的硝化細菌具有抗性強、活性高的特性,而用總菌體量作為硝化活性評價指標會產生虛高現象.

2.2 硝化產物對硝化細菌混培物性狀的影響

2.2.1 硝化產物對生化性狀的影響 血紅素是硝化細菌中血紅蛋白的重要輔基,ATP則是硝化細胞中重要的能量載體,因此兩者的含量可以反映硝化細菌的生理狀況.饑餓保藏時,硝化細菌混培物中血紅素c和ATP含量保留率與時間的關系見表2.

表2 保藏過程中血紅素c和ATP保留率的變化Table 2 The change of heme c and ATP during preservation

饑餓保藏過程中,各種方法下的硝化細菌混培物血紅素c含量和ATP含量均隨保藏時間的延長而下降,且兩者的衰減速率均隨硝化活性衰減速率的變化而變化,但兩者的總體衰減速率要小于硝化活性的總體衰減速率,這與實驗室已有實驗結果相符.這也進一步證明,硝化細菌混培物血紅素c含量和ATP含量可用于定性的表示硝化細菌混培物的硝化活性,但與硝化活性間不具有線性相關性.

2.2.2 硝化產物對物化性狀的影響 饑餓保藏過程中,混培物上清液中可溶性 COD(SCOD)和混培物沉降比(SV30)隨時間的變化如圖3所示.由圖3(a)可知, R1、R2和R3的SCOD值均隨著饑餓時間的延長而增加,且 R3的增長速率明顯快于R1和R2,但相比于菌體衰減理論COD值,3者混培物上清液中增加的SCOD均可忽略不計,增加的最大SCOD值也僅為菌體衰減理論COD值的0.24%,進一步證明饑餓情況下活菌會利用死亡菌體水解產物的推測是正確的.由圖3(b)可知,R1、R2和R3的SV30值下降速率均是先快后慢,但隨保藏時間的延長3者間的變化差異不大,且在試驗期間SV30值沒有像實驗室溫度保藏試驗[17]一樣最終趨于穩定.

圖3 SCOD和SV30值隨時間的變化Fig.3 The change of SCOD and SV30during preservation

2.2.3 硝化產物對形態結構的影響 保藏過程中,硝化細菌混培物顏色和菌群結構均發生了明顯變化.由圖4可知,各方法下的混培物顏色隨保藏時間的延長均從下至上逐漸變黑,但不同方法間又有一些差異.R1和R2中的混培物保藏60d后出現混培物上浮現象,且可見明顯的氣泡,但隨著保藏時間的進一步延長此現象又消失,而 R3中自始至終都無此現象;另外,保藏過程中 R1和R2的混培物顏色變化速率相比于 R3來說是先慢后快.測定混培物中的硫化物含量發現,混培物中的硫化物含量與顏色變化成正相關.這主要是因試驗用硝化細菌混培物中含有部分反硝化細菌,其可以以死亡菌體產生的有機物為電子供體,以加入或產生的亞硝態氮和硝態氮為電子受體發生反硝化反應,而隨硝化產物的逐漸減少反硝化作用會慢慢減弱.缺氧環境中,某些氨氧化細菌可利用反硝化作用產生的NO或NO2取代氨氧化過程中氧氣的常規電子受體地位而發生厭氧氨氧化反應,從而減少了硝化細菌對 O2的需求,降低了硫酸鹽被還原的速度,所以硝化細菌混培物保藏初期加有硝化產物的混培物顏色變化較不加硝化產物要慢,而當反硝化作用減弱時混培物顏色變化速率加快并最終與不加硝化產物趨于一致.

從圖5可以看出,與保藏前相比,R2和R3中的絲狀菌比例增加,絮體結構變得松散,而 R1中的絲狀菌不但沒有增加反而有下降的趨勢,絮體結構更加緊密.表明硝化細菌混培物的饑餓保藏過程中加入亞硝態氮可以保持球菌的優勢地位.

圖4 混培物顏色隨保藏時間的變化Fig.4 The change of color during preservation

圖5 保藏過程中混培物結構的變化的掃描電鏡圖像Fig.5 SEM graph of change of mixed culture structure

3 結論

3.1 在硝化細菌混培物饑餓保藏過程中,亞硝態氮可明顯降低硝化活性的衰減速率.4℃加5mmol/L亞硝態氮、4℃加5mmol/L硝態氮、4℃3種保藏方法的硝化活性衰減速率分別為0.010d-1、0.020d-1、0.021d-1,半衰期分別為72.3、33.9、32.7d.

3.2 在硝化細菌混培物饑餓保藏過程中,總菌體量用作硝化活性的評價指標會產生虛高現象.活性趨于穩定時,采用4℃加5mmol/L亞硝態氮、4℃加5mmol/L硝態氮、4℃ 3種方法保藏的硝化細菌混培物活性保留率分別為18.7%、19.1%、15.1%,總菌體量保留率分別為 62.0%、47.3%和58.7%.

3.3 在硝化細菌混培物饑餓保藏過程中,混培物血紅素c含量和ATP含量可用于定性表征硝化活性.4℃加 5mmol/L亞硝態氮、4℃加5mmol/L硝態氮、4℃ 3種保藏方法的血紅素c和ATP含量均隨硝化活性的衰減而下降.

3.4 在硝化細菌混培物饑餓保藏過程中,硝化產物可減慢混培物變黑速度.保藏前期,4℃加5mmol/L亞硝態氮和4℃加5mmol/L硝態氮兩方法的硫化物生成速度慢于4℃方法.

[1] 陳婷婷,鄭 平.硝化基質和產物對發光細菌的急性毒性 [J].微生物學報, 2009 49(6):759-765.

[2] 唐崇儉,鄭 平.厭氧氨氧化膨脹污泥床反應器的化學計量學特性 [J]. 中國環境科學, 2010, 30(11):1446-1452.

[3] Stein L Y, Arp D J. Ammonium limitation results in the loss of ammonia-oxidizing activity in Nitrosomonas europaea [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998,64(4):1514-1521.

[4] Yarbrough J M, Rake J B, Eagon R G. Bacterial inhibitory effects of nitrite: inhibition of active transport, but not of group translocation, and of intracellular enzymes [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1980,39(4):831-834.

[5] Sharma B, Ahler R C. Nitrification and nitrogen removal [J]. Water Research, 1977,11:897-925.

[6] Vlaeminck S E, Geets J, Vervaeren H, et al. Reactivation of aerobic and anaerobic ammonium oxidizers in OLAND biomass after long-term storage [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007,74(6):1376-1384.

[7] Laurin V, Labbe V, Juteau P, et al. Long-term storage conditions for carriers with denitrifying biomass of the fluidized, methanol-fed denitrification reactor of the Montreal Biodome, and the impact on denitrifying activity and bacterial population. [J] Water Research, 2006, 40(9):1836-1840.

[8] Vogelsang C, Gollembiewski K, Ostgaard K. Effect of preservation techniques on the regeneration of gel entrapped nitrifying sludge [J]. Water Research, 1999, 33(1):164-168.

[9] 盧 剛,鄭 平.氣升式內循環反應器短程硝化控制策略的研究[J]. 浙江大學學報(工學版), 2005, 39(4):542-546.

[10] 國家環境保護總局.水和廢水監測分析方法 [M]. 4版.北京:中國環境科學出版社, 2002.

[11] 姚槐應,黃昌勇.土壤微生物生態學及其實驗技術 [M]. 北京:科教出版社, 2005:143-144.

[12] Thore A, Lundin A. Firefly luciferase ATP assay as a screening method for bacteriuria [J]. Journal of clinical microbiology, 1983, 17(2):218-224.

[13] Berry E A, Trumpower B L. Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra [J]. Analytical Biochemistry, 1987,161(1):1-15.

[14] Carr G J, Page M D, Ferguson S J. The energy-conserving nitric-oxide-reductase system in Paracoccus denitrificans. distinction from the nitrite reductase that catalyses synthesis of nitric oxide and evidence from trapping experiments for nitric oxide as a free intermediate during denitrification [J]. European Journal of Biochemistry, 1989,179(3):683-692.

[15] Goretski J, Hollocher T C. The kinetic and isotopic competence of nitric oxide as an intermediate in denitrification [J]. The Journal of Biological Chemistry, 1990,265(2):889-895.

[16] Zart D, Schmidet I, Bork E. Significance of gaseous NO for ammonia oxidation by Nitrosomonas eutropha [J]. Antonie Leeuwenhoek, 2000,77:49-55.

Influence of nitration product on the preservation characteristics of mixed nitrifying culture.

WANG Cai-hua1,2, ZHENG Ping1*, HU An-hui1(1.Department of Environmental Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China；2.Beijing Tiandiren Environment and Technology Corporation limited, Beijing 100176, China). China Environmental Science, 2011,31(10)：1663～1668

Influence of nitration product on the preservation characteristics of mixed nitrifying culture was studied. Nitrite could decrease the decay rate of nitrifying activity, and also improve the other characteristics during the starvation period. Under the anaerobic conditions of 4℃ with 5mmol/L nitrite, 4 ℃ with 5mmol/L nitrate and 4℃, the decay rate of nitrifying activity was 0.010/d, 0.020/d and 0.021/d, and the half-life was 72.3, 33.9 and 32.7d, respectively. After 5months’ preservation, the relative activity survival and relative biomass survival were 18.7%, 19.1%, 15.1%, and 62.0%, 47.3%, 58.7%, respectively. With storage time prolonging and the activity decayed, the heme c and ATP contents decreased, and the mixed nitrifying culture changed to black gradually.

mixed nitrifying culture；nitration product；preservation characteristics

X 703.1

A

1000-6923(2011)10-1663-06

2011-01-22

國家“863”項目(2009AA06Z311);國家自然科學基金資助項目(30770039)

* 責任作者, 教授, pzheng@zju.edu.cn

汪彩華(1983-),女,安徽省安慶市人,浙江大學環境工程系碩士研究生,主要從事廢水生物處理方面的研究.發表論文4篇.