一株油脂降解菌的性能研究

齊香君，徐婷婷，張雯，冉登元

(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安，710021)

一株油脂降解菌的性能研究

齊香君，徐婷婷，張雯，冉登元

(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安，710021)

為 尋找高效的油脂降解菌，從餐廳油煙排出口附近篩選出一株油脂降解菌QZX-A，并采用形態學、生理生化鑒定、基因測序等方法對其進行分類鑒定;采用比濁法和稱重法對該菌株的生長性能進行研究;采用排油圈法及蒽酮硫酸法研究了QZX-A菌株生產鼠李糖脂的性能。結果:形態學指標、生理生化指標均顯示QZX-A菌株具備銅綠假單孢桿菌的特征，基因測序結果表明QZX-A菌株基因序列與銅綠假單孢桿菌序列的相似度達98%;QZX-A菌株在牛肉膏蛋白胨培養基和發酵培養基中具有相似的生長曲線，但前者的生長速率大于后者;QZX-A菌株代謝產物屬于糖脂類化合物，其排油圈可達11 cm，產量為567.75 mg/L。QZX-A菌株遺傳性狀穩定。

油 脂降解，銅綠假單胞菌，鼠李糖脂

隨著餐飲業蓬勃發展，餐飲廢水日益增多。這些油脂廢水如不經處理排放后會飄浮于水體表面，影響水體的復氧及其自然凈化過程，危害水體生態系統并且對周圍環境造成嚴重污染［1］。因此，找到一種簡便、快速、高效的方法來處理餐飲廢水中的油脂，以解決這一刻不容緩的環境問題。本研究根據Bergey系統和常見細菌鑒定方法結合基因測序等方法對從教職工餐廳油煙排污口分離出的能利用菜籽油的細菌QZX-A進行分類鑒定研究;利用比濁法和重量法對該菌株的生長性能進行研究;應用蒽酮硫酸法及排油圈法，研究了QZX-A菌株代謝鼠李糖脂的生產性能。通過測定多次傳代后QZX-A菌株的形態和鼠李糖脂的生產能力研究了該菌株的遺傳性能。這為該菌株的開發應用研究奠定基礎。

1 試藥與儀器

1.1 QZX-A菌株來源

教職工餐廳油煙排出口分離篩選得到。

1.2 培養基配制

(1)分離培養基:KH2PO40.05%，K2HPO40.1%，(NH4)2SO40.1%，MgSO4·7H2O 0.01%，NaCl 0.5%，菜籽油3 mL/L，混合乳化劑(司盤-80∶吐溫-80=1∶1.14)5 mL/L，瓊脂 2%，pH 7.5;(2)發酵培養基:KH2PO40.05%，K2HPO40.05%，(NH4)2SO40.1%，MgSO4·7H2O 0.01% ，菜籽油2%，pH8;(3)保藏培養基:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH7.5

1.3 顯色劑配制

(1)茚三酮顯色劑:0.5 g茚三酮溶于100 mL的無水丙酮中;(2)蒽酮顯色劑:1 g蒽酮和5 mL硫酸溶于95 mL的乙醇中。

1.4 主要儀器設備

DPX-9082B-1培養箱，HYG-Ⅱa回轉式恒溫調速搖瓶柜，752型紫外分光光度計

2 試驗方法

2.1 蒽酮硫酸法

取適當稀釋倍數的發酵液1.0 mL置試管中，于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮試劑4 mL，加完后混合均勻浸于沸水浴中，15 min后取出，用自來水冷卻，室溫放置20 min。空白對照以未接種的培養基代替發酵液，620 nm處進行紫外檢測［2］。

2.2 排油圈法

取一直徑20cm培養皿，加入200 mL蒸餾水，水面中央加250μL液體石蠟形成油膜。在油膜中心加250μL發酵液，中心油膜被擠向四周形成排油圈，記錄排油圈的直徑［3］。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態學研究

采用菌落觀察、染色及顯微觀察的方法，對菌落大小、性狀、光澤、顏色、硬度、透明度，菌體顯微形態(100×)，革蘭氏染色，以及是否運動，是否產色素等方面對菌體進行詳細描述，根據Bergey系統進行分類［4］。

2.3.2 生理生化鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》［4］，對篩選得到的菌株進行接觸酶實驗、葡萄糖氧化發酵實驗、甲基紅(M.R)實驗、V-P測定、吲哚實驗等生理生化試驗。

2.3.3 16srDNA序列測定

①將QZX-A菌株純培養物于12 000 r/min離心3 min，收集菌體加入2.7 mL DNA抽提Buffer，充分懸浮，加入20 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，37℃振蕩30 min。②加入0.3 mL 20%SDS，混勻后于65℃恒溫靜置2 h，期間每20 min上下顛倒幾次，12 000 r/min離心10 min。③將上清液轉至離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1，V/V)抽提 10 min，于 12 000 r/min離心10 min。重復該步驟1次。④將上清轉至離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫靜置1 h后于14 000 r/min離心10 min收集粗DNA。⑤沉淀的粗DNA用70%冰乙醇輕輕刷洗，棄刷洗液后晾干。⑥加入無菌超純水溶解DNA后用核酸/蛋白分析儀于Nucleic Acid程序下測定其濃度。⑦PCR擴增反應程序:94℃5 min;94℃30 min，56℃30 min，72℃2 min，30個循環;72℃，10 min。⑧取擴增產物5μL電泳，于UVI凝膠成像系統分析結果。⑨將擴增產物送上海英駿生物技術有限公司進行測序。測序結果用Blast軟件進行同源性比較［3］。

2.4 不同培養條件下的生長特性

分別繪制QZX-A菌株在牛肉膏蛋白胨培養基和發酵培養基中生長曲線:采用比濁法和稱重法［5］。

2.5 QZX-A菌株生產鼠李糖脂性能研究

2.5.1 代謝產物的定性

取30℃，130 r/min培養3 d的發酵液及表面活性劑粗品進行TLC層析，以V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=70∶10∶0.5為展開劑，用不同的顯色劑顯色:(1)茚三酮顯色劑，脂肽顯紅色;(2)蒽酮顯色劑，糖脂顯黃色斑點。

2.5.2 排油性能

取30℃，130 r/min培養3 d的發酵液，適當稀釋后，采用排油圈法，記錄排油圈直徑，初步判斷產物中是否含表面活性劑及含量多少。

2.5.3 產鼠李糖脂性能

取30℃，130 r/min培養3 d的發酵液，適當稀釋后，采用蒽酮硫酸法測定發酵液中鼠李糖的量。鼠李糖脂產量=×3×n(n=發酵液稀釋倍數)。

2.6 遺傳穩定性考察

采用牛肉膏蛋白胨固體培養基連續傳代的方法，通過對每代菌種進行形態學觀察;通過發酵培養基液體培養測定其代謝產物鼠李糖脂的含量，研究QZXA菌株的遺傳穩定性。

3 結果與討論

3.1 QZX-A菌株的鑒定

3.1.1 形態學鑒定

菌落呈圓形，邊緣整齊，直徑2mm左右，表面濕潤，薄，中間略突起，在含油平板上有較明顯的透明圈，如圖1(A)。顯微鏡下(100×)QZX-A菌株為短桿狀細菌，末端鈍圓，革蘭氏陰性，無芽孢，不運動，如圖1(B)。產綠色素，平板培養后期綠色素浸透整個平板，在牛肉膏蛋白胨液體培養基中呈均勻混濁狀態，綠色素分布在液面附近，如圖1(C)所示。

圖1 QZX-A形態學鑒定

3.1.2 生理生化鑒定

對QZX-A菌株進行糖發酵、過氧化氫酶等生理生化試驗。該菌株的生理生化特征見表1。

表1 QZX－A菌株的生理生化特征

3.1.3 基因測序鑒定

將測序結果與GenBank中已報道的基因序列進行同源性比較，發現QZX-A與銅綠假單胞菌的同源性達到98%，與其同源性最接近的菌種為Pseudomonas aeruginosa(AY825034)。

綜上分析表明，QZX-A的形態學觀察結果、生理生化指標與假單孢菌屬的特性完全吻合，測序結果與GenBank中的序列進行同源性比較，發現QZX-A與銅綠假單胞菌的同源性達到98%，。因此確定QZXA為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。上傳其基因序列至 NCBI Genbank，得到該菌株序列號HQ221563。

3.2 QZX-A菌株在不同培養條件下的生長特性

為掌握該菌株的生長特性，測定了該菌株在牛肉膏蛋白胨培養基和發酵培養基中的生長曲線，結果見圖2，可以看出，牛肉膏蛋白胨培養基中菌體12 h已進入穩定期，發酵培養基中菌體在30 h才進入穩定期。在發酵培養基中的對數期比牛肉膏蛋白胨培養基中QZX-A的對數期延長18 h。其原因可能是微生物對油脂的利用速度較慢。

圖2 不同培養條件下QZX-A的生長性能

3.3 代謝產物生產性能研究

3.3.1 代謝產物的定性

為判斷代謝產物類別，利用TLC法對其進行鑒別。對分離的斑點經蒽酮顯色劑顯色后，鼠李糖脂粗提物與發酵液都顯黃綠色斑點，鼠李糖脂粗提物斑點略大于發酵液斑點，判斷此種表面活性劑為糖脂類化合物，Rf=0.567。文獻表明銅綠假單孢桿菌有產鼠李糖脂的性能，因此可推斷代謝產物中含有鼠李糖脂。

3.3.2 排油圈的測定

為初步測試研究菌株代謝鼠李糖脂的能力，取不同培養時間的發酵液測其排油圈直徑，結果見圖3。由圖可知，排油圈的直徑隨著發酵時間的遞增而增大，60h后增加趨勢逐漸減緩，120 h發酵液的排油圈直徑達11.2 cm。

3.3.3 鼠李糖脂的定量測定

為了準確了解QZX-A菌株產鼠李糖脂的能力，對30℃，130 r/min培養不同時間的QZX-A菌株發酵液采用蒽酮硫酸法測定其鼠李糖脂的量，結果見圖3，鼠李糖脂產量在60 h前快速增長，60 h后趨于平緩，略有升高，120 h時鼠李糖脂的產量達1 286 mg/L。曲線趨勢平緩表明60 h后菌株產鼠李糖脂的能力基本達到最大，為后期發酵條件的考察打下基礎。

圖3將不同發酵時間的排油圈直徑變化與鼠李糖脂產量變化做了比較，發現兩者的變化趨勢一致，60 h前呈快速增長趨勢，60 h后呈較平穩趨勢。由此推斷，發酵液的排油圈直徑與鼠李糖脂含量成正比關系。由于排油圈的測量較簡便快捷，可采用排油圈法代替蒽酮硫酸法初步判斷菌種產鼠李糖脂的能力。

3.4 遺傳穩定性考察

為了解實驗菌株的遺傳穩定性，在固體斜面連續傳代10次，對每代的QZX-A菌株進行形態學觀察、定量測定發酵液鼠李糖脂含量，結果表明QZX-A產鼠李糖脂的性狀穩定，轉接10代的平均產量為1 057.75 mg/L。

經形態學觀察，QZX-A菌株多次傳代后在外觀形態，色素產生方面都與原始菌株保持一致，表明QZX-A菌株的具有良好的遺傳穩定性。

圖3 QZX-A產鼠李糖脂性能

4 結論

(1)本研究所用菌株QZX-A，為假單孢菌屬的銅綠假單孢菌。

(2)QZX-A菌株在降解油脂的過程中能夠產生表面活性劑，初步鑒定為鼠李糖脂。

(3)120h內QZX-A菌株發酵液的排油圈直徑與發酵液中鼠李糖脂含量成正比關系。60 h后鼠李糖脂產量的增加趨于平緩，120h時鼠李糖脂的產量最大，達到1 286 mg/L。

(4)QZX-A菌株在10代內，其外觀形態、產色素性能、產鼠李糖脂能力等遺傳性狀穩定。

［1］ 袁惠民.含油廢水的處理方法［J］.化工環保，1998，18:146.

［2］ 盧滿國，劉紅玉，曾光明，等.鼠李糖脂快速定量分析及其影響因素研究［J］.微生物學通報，2006，33(4):106－111.

［3］ 賈燕，尹華，彭輝，等.一株表面活性劑產生菌的篩選及其特性研究［J］.微生物學通報，2007，34(6):1 066－1 070.

［4］ 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊［M］.北京:科學出版社，2001.

［5］ 周德慶.微生物學教程［M］.北京:高等教育出版社，2002.

Research on the Property of an Oil-degrading Bacteria

Qi Xiang-jun，Xu Ting-ting，Zhang Wen，Ran Deng-yuan
(Colloge of Life Science and Engineering in Shaanxi university of Science and Technology，Xi＇an 710021，China)

In order to select a high-efficient oil-degrading bacteria，here an oil-degrading bacteria was selected from the lampblack exit of the restaurant，which was named QZX-A.Then，it was identified using the methods such as morphological，physiological and biochemical identification and 16S rRNA.At the same time，its growth performance was anaylzed by the turbidimetric and weighing methods.Furthmore，its ability to produce rhamnolipid was discussed by the method oil-spreading and anthrone-sulfuric acid.Results:On the basis of morphological，physiological and biochemical evidence，strain QZX-A had the characteristics of Pseudomonas aeruginosa bacteria.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences revealed that QZX-A belonged to a phyletic sub-lineage within the family Pseudomonas，with≥98%16S rRNA gene sequence similarity to the described species.In addition，strain QZX-A had a similar growth curve in beef extract peptone and fermentation medium，but the growth rate of the former was bigger than the latter.The result of TLC showed that the metabolic products of strain QZX-A belonged to glycolipid compounds.The oil-spreading round was up to 11cm，and its productivity was 567.75 mg/L.In sum，since strain QZXA was genetically stable，it had some value of development in the degradation of oil and in the production of rhamnolipid.

oil-degradation，Pseudomonas aeruginosa，rhamnolipid

碩士，教授。

2010－09－06，改回日期:2010－10－14