HPLC－ELSD法測定纈氨酸樣品中雜質(zhì)氨基酸的含量

任洪發(fā)

（廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東 肇慶526070）

HPLC－ELSD法測定纈氨酸樣品中雜質(zhì)氨基酸的含量

任洪發(fā)

（廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東 肇慶526070）

建立了反相高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC－ELSD）測定纈氨酸樣品中雜質(zhì)氨基酸含量的方法。 采用Hypersil BDS C18色譜柱（4．6×250mm，5μm），以0．1%三氟乙酸乙腈溶液－0．1%三氟乙酸水溶液為流動相進(jìn)行線性梯度洗脫， 流速為0．8mL·min－1， 在漂移管溫度60℃， 氮氣流量1．5L·min－1的條件下，在25min內(nèi)完成纈氨酸樣品中雜質(zhì)氨基酸的分離測定。在線性范圍內(nèi)，各組分進(jìn)樣質(zhì)量的常用對數(shù)值與峰面積的常用對數(shù)值均呈良好的線性關(guān)系。精密度和重復(fù)性較好，樣品的加樣回收率為97．5%～98．0%。該方法檢測速度快、檢測過程簡單方便、檢測結(jié)果準(zhǔn)確可信，可以作為纈氨酸樣品中雜質(zhì)氨基酸含量的檢測方法，也為其他原料藥中氨基酸的分析提供了參考。

反相高效液相色譜；蒸發(fā)光散射檢測；氨基酸；纈氨酸

L－纈氨酸含有5個碳原子，支鏈結(jié)構(gòu)，屬于中性氨基酸，是人體必需氨基酸之一。它的用途廣泛，在醫(yī)藥工業(yè)，作為營養(yǎng)增補(bǔ)劑，主要用以配制復(fù)合氨基酸輸液、合成多肽藥物和食品抗氧化劑等，在食品工業(yè)，可用作食品添加劑、營養(yǎng)增補(bǔ)液及風(fēng)味劑等。在飼料工業(yè)，用于豬飼料中，對母豬乳腺組織分泌乳汁有重要的促進(jìn)作用。另外，以纈氨酸為原料可以合成纈更昔洛韋、纈沙坦等原料藥。纈氨酸的生產(chǎn)主要采用生物發(fā)酵法，副生的雜質(zhì)氨基酸比較多，并且雜質(zhì)氨基酸結(jié)構(gòu)與纈氨酸相近，難以除去。因此，在纈氨酸的菌種選育、發(fā)酵調(diào)節(jié)、提取精制等試驗研究［1～3］的過程中，需要對纈氨酸樣品中雜質(zhì)氨基酸的含量進(jìn)行監(jiān)控。研究一種快速、簡便、高效的檢測雜質(zhì)氨基酸含量的方法具有重要的意義。

目前，氨基酸的分析方法主要有柱后衍生離子交換色譜法、柱前衍生高效液相色譜法和離子色譜法［4］。衍生法操作繁雜，衍生試劑昂貴，離子色譜法儀器成本高。試驗研究中樣品成分復(fù)雜，檢測頻率高，需要開發(fā)低成本、高效率的檢測方法。有文獻(xiàn)報道，利用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC－ELSD）檢測氨基酸無需衍生，應(yīng)用范圍廣，適用于快速測定氨基酸［5～7］。 本文嘗試采用HPLC－ELSD法對纈氨酸樣品中的雜質(zhì)氨基酸進(jìn)行檢測。該方法快速、簡便，分離效果好，適用于纈氨酸試驗研究中雜質(zhì)氨基酸的快速檢測。

1 實驗部分

1．1 儀器及試劑

Agilent1200高效液相色譜儀，蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）3300，ME215S型電子天平，。

纈氨酸（Val）、丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、三氟乙酸（TFA）、乙腈（色譜純）、纈氨酸供試樣品。

1．2 標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液和供試品溶液的制備

分別精密稱取丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各約25 mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解，稀釋定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)品混合液。

精密稱取纈氨酸供試樣品約100 mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解，稀釋定容，配制成供試樣品溶液。

1．3 色譜條件

色譜柱Hypersil BDS C18 4．6×250 mm，5 μm。流動相：（A）0．1%三氟乙酸乙腈溶液；（B）0．1%三氟乙酸水溶液。線性梯度洗脫程序：0～5 min，0%A，20 min時升至40%A，25 min時降至0%A；流速0．8 mL·min-1；柱溫35℃。 漂移管溫度60℃；氮氣流量1．5 L·min-1；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與討論

2．1 流動相的選擇

對比甲醇水溶液與乙腈水溶液的分離效果，甲醇水溶液得到的峰形比較差，部分組分沒有完全分離，乙腈水溶液分離效果稍好，各峰基線分離，少量拖尾。在水相中加入三氟乙酸后分離效果明顯改善，因為需要采用梯度洗脫，同時在溶劑相中也加入三氟乙酸后分離效果更佳。對兩相中 加 入 三 氟 乙 酸 的 量 （0．05%、0．10%，0．15%，0．20%）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，三氟乙酸的濃度對峰形有影響，采用0．1%濃度的三氟乙酸效果較佳。各峰基線分離，峰形尖銳，對稱性良好。因此，選擇兩相中加入0．1%濃度的三氟乙酸進(jìn)行檢測試驗。

各種氨基酸的保留時間差別比較大，要同時分析幾種氨基酸的含量，需要進(jìn)行梯度洗脫，在保證分離效果的情況下進(jìn)行梯度洗脫減少分析時間。在上述流動相研究的基礎(chǔ)上，試驗了不同梯度洗脫條件對分離效果的影響。在前面色譜條件中所述的線性梯度洗脫程序下，在25 min內(nèi)可以同時檢出纈氨酸樣品中的雜質(zhì)氨基酸成分。

2．2 檢測器參數(shù)的選擇

蒸發(fā)光散射檢測器的檢測包括霧化、蒸發(fā)和檢測三個步驟。漂移管溫度和氣體流量是影響檢測結(jié)果的重要因素。漂移管溫度越高，流動相越容易蒸發(fā)，溫度過低會導(dǎo)致流動相蒸發(fā)不完全，基線噪音大。氣體流量越大，形成的氣溶膠越小，靈敏度降低。因此，需要選擇合適的漂移管溫度和氣體流量。ELSD3300中安裝有撞擊器，只有部分氣溶膠通過漂移管進(jìn)入到光散射檢測池被檢測。本研究中考察了漂移管溫度（40，50，60，70，80，90℃）和氮氣流量（1．0，1．5，2．0，2．5 L·min-1）對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果表明，在漂移管溫度60℃，氮氣流量1．5 L·min-1時，基線平直，噪音小，靈敏度高。 因此，選擇漂移管溫度60℃，氮氣流量1．5 L·min-1進(jìn)行檢測。

2．3 線性關(guān)系考察

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品混合液0．5，2，4，6，8，10 mL分別置于100 mL的容量瓶中，加水稀釋至刻度，各取20 μL進(jìn)樣。按照上述色譜和檢測器條件進(jìn)行檢測，以各氨基酸組分峰面積的常用對數(shù)值Y為縱坐標(biāo)，以各氨基酸組分進(jìn)樣質(zhì)量的常用對數(shù)值X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，結(jié)果見表1。在上述線性范圍內(nèi)，各組分進(jìn)樣質(zhì)量的常用對數(shù)值與峰面積的常用對數(shù)值均呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab1 The results of linear test

2．4 精密度和重復(fù)性試驗

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品混合液4 mL置于100 mL的容量瓶中，加水稀釋至刻度，取20μL進(jìn)樣。按照上述色譜和檢測器條件進(jìn)行檢測，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得各組分色譜峰保留時間波動為小于0．3 min，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0．36%～1．92%。說明檢測方法精密度較好。

取同一批纈氨酸供試樣品，按照供試品溶液制備方法平行制備5份樣品，分別進(jìn)樣20μL。精密吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品混合液置于100mL的容量瓶中，加水稀釋至刻度，取20μL進(jìn)樣。按外標(biāo)兩點對數(shù)方程法計算含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果為0．65%～2．06%。 說明檢測方法重復(fù)性良好。

2．5 回收率試驗

精密稱取纈氨酸供試樣品約100 mg，置于容量瓶中，加入適量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，按照供試品溶液的配制方法進(jìn)行溶液配制，在上述色譜和檢測器條件下進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。說明檢測方法回收率比較好。

表2 纈氨酸供試樣品中丙氨酸和亮氨酸的加樣回收率（n=3）Tab2 Recoverles of alanine and leucine added（n=3 ）

2．6 樣品分析

取同一批纈氨酸供試樣品，按照供試品溶液制備方法平行制備3份樣品，分別進(jìn)樣20 μL。精密吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品混合液置于100 mL的容量瓶中，加水稀釋至刻度，取20 μL進(jìn)樣。在上述色譜和檢測器條件下進(jìn)行檢測，按外標(biāo)兩點對數(shù)方程法計算含量。HPLC－ELSD色譜圖見圖1，含量檢測結(jié)果見表3。纈氨酸供試樣品中主要雜質(zhì)氨基酸為丙氨酸和亮氨酸。

圖1 纈氨酸供試樣品HPLC－ELSD色譜圖Fig.1 Chromatogram of a solution of valine products

表3 纈氨酸供試樣品中丙氨酸和亮氨酸的含量（n=3）Tab3 The results of analysis for alanine and leucine in valine products（n=3 ）

3 結(jié)論

本研究對纈氨酸樣品中的主要雜質(zhì)氨基酸丙氨酸和亮氨酸的含量進(jìn)行了分析。由于纈氨酸中丙氨酸和亮氨酸雜質(zhì)難以通過簡單處理除去，因此，主要研究了纈氨酸中雜質(zhì)氨基酸丙氨酸和亮氨酸的含量檢測方法。其它雜質(zhì)氨基酸的檢測方法可以參考本研究進(jìn)行試驗。高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用檢測氨基酸的方法，樣品不需要衍生化就可以直接進(jìn)樣分析，簡化了樣品的前處理過程，減小了檢測誤差，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。該方法可以用于試驗研究中發(fā)酵液、中間濾液和粗品等纈氨酸樣品的質(zhì)量控制。

［1］ 王平，何英，賀小偉，等．L-纈氨酸菌種的選育及其發(fā)酵條件 ［J］．大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2002，21（2）：116-119．

［2］ 陳剛，王開國，浦軍平，等．改進(jìn)L-纈氨酸發(fā)酵工藝的實驗研究［J］．大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2003，22（1）：41-43．

［3］ 秦永鋒，徐慶陽，謝希賢，等．檸檬酸鈉對L-纈氨酸發(fā)酵及代謝流量分布的影響 ［J］．天津科技大學(xué)學(xué)報，2010，25（2）：10-12．

［4］ 于泓，牟世芬．纈氨酸產(chǎn)品中微量氨基酸雜質(zhì)的高效陰離子交換色譜－積分脈沖安培測定［J］．分析測試學(xué)報，2007，26（6）：862-865．

［5］ 鄢丹，韓玉梅，董小萍．反相高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法同時測定阿膠中的17種未衍生氨基酸［J］．色譜，2006，24（4）：359-362．

［6］ 鄢丹，張毅，韓玉梅，等．HPLC－ELSD法測定疏血通注射液中17種未衍生氨基酸含量 ［J］．藥物分析雜志，2007，27（4）：558-560．

［7］ 陳鼎雄，林立．HPLC－ELSD法測定復(fù)方氨基酸注射液（3AA）中三組分的含量［J］．藥物分析雜志，2007，27（10）：1649-1651．

Determination of Amino Acid Impurities in Valine Samples by HPLC－ELSD

REN Hong-fa
（Star Lake Bioscience Co．，Inc．，of Zhaoqing Guangdong，Zhaoqing 526070，China）

An analytical method to determine amino acid impurities in valine samples was established by reversed-phase high performance liquid chromatography（HPLC）coupled with evaporative light-scattering detection（ELSD）．A hypersil BDS C18 column was used with the mobile phase of 0．1%trifluoroacetic acid acetonitrile solution-0．1%trifluoroacetic acid solution．Under the condition of solvent gradient elution，the detection was performed at the drift tube temperature of 60℃and the nitrogen flow rate of 1．5 L／min．The flow rate was 0．8 mL／min．The amino acid impurities were separated in 25min．The calibration curves were showed good linearity in the linear range．The experimental results showed that the method had good precision and repeatability，the recovery was 97．5%～98．0%．The method was simple and rapid．The determined results were accurate and reliable．

reversed-phase high performance liquid chromatography；evaporative light-scattering detection；amino acid；valine

O 657．31

A

1671-9905（2011）06-0038-03

任洪發(fā)（1976-），男，湖北嘉魚人，工程師，主要從事食品添加劑和醫(yī)藥原料藥的合成研究及管理工作

2011-03-23