響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取紅曲米中水溶性色素＊

嵇 豪， 蔣冬花， 楊 葉， 周 琴， 王長春

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

食用色素是食品工業(yè)、制藥工業(yè)和日化工業(yè)不可缺少的一類添加劑，按其來源可分為天然色素和合成色素2種．近年來，由于安全問題，部分合成色素被限制使用，因此開發(fā)利用無毒的天然色素日益受到人們的重視［1］．利用食品安全級微生物合成天然色素是一種比較理想的途徑．紅曲色素是紅曲霉(monascus spp．)生長過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物．紅曲霉固體發(fā)酵制取紅曲米，是當(dāng)前紅曲色素的主要生產(chǎn)方式［2］．我國于1985年制定了紅曲米作為食品添加劑的國家標(biāo)準(zhǔn)．產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)紅曲色素主要采用60%～80%的乙醇溶液對紅曲米浸提，提取液經(jīng)蒸發(fā)濃縮，再經(jīng)真空干燥或噴霧干燥，即生產(chǎn)出商品化的紅曲色素粉［3］．這種紅曲色素粉色素成分較雜，主要為水不溶性的紅斑素和紅曲紅素等，因此很大程度制約了其應(yīng)用場合．水溶性紅曲色素則具有食用方便、無酒精異味等優(yōu)點(diǎn)，因此，開發(fā)水溶性紅曲色素具有一定的現(xiàn)實(shí)意義．

近年來，超聲波法在生物技術(shù)和食品加工領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)大能量加速細(xì)胞壁的破裂和物料中有效成分的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散，從而達(dá)到提取的目的［4］．目前，有關(guān)超聲波輔助提取植物中有效成分的報(bào)道較多［5-7］，但利用超聲波輔助提取紅曲米中的水溶性紅曲色素未見報(bào)道．本實(shí)驗(yàn)以去離子水為提取溶劑，超聲波輔助提取紅曲米中的水溶性色素，并采用響應(yīng)面法對色素提取的最佳工藝進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為直接提取紅曲米中水溶性色素提供一個(gè)可行的工藝方法．

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

紅曲米為本實(shí)驗(yàn)室保藏的紅曲霉菌株Mp-41經(jīng)固體發(fā)酵制得．

1．2 主要儀器和設(shè)備

MIKRO 22R高速冷凍離心機(jī)(德國Hettich公司);UV-7504紫外可見分光光度計(jì)(上海欣茂有限公司);JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司);RO型反滲透純水儀(美國Kflow公司)．

1．3 水溶性紅曲色素的測定

水溶性紅曲色素的測定采用分光光度法．將紅曲米研磨后，加入適量的去離子水，經(jīng)超聲波輔助提取及冷凍離心后，適當(dāng)稀釋，測定其紫外可見光吸收光譜．

1．4 單因素實(shí)驗(yàn)

選擇超聲時(shí)間、液料比(V(去離子水)∶m(紅曲米))和超聲功率3個(gè)因素，分別考察了各因素對水溶性紅曲色素提取的影響，以確定各相關(guān)因素的作用范圍．

1．5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

綜合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［8］，對超聲時(shí)間、液料比和超聲功率3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，確定最優(yōu)的提取工藝．各實(shí)驗(yàn)組的編碼及取值見表1，共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，3個(gè)為零點(diǎn)．

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼

1．6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)用設(shè)計(jì)分析軟件為Design Expert 6．0．

2 結(jié)果與分析

2．1 水溶性紅曲色素的紫外可見光吸收光譜

將紅曲米粉的超聲波水提取液在300～600 nm進(jìn)行紫外可見光譜掃描．結(jié)果(見圖1)表明，該水溶性色素在黃色特征吸收波長范圍內(nèi)的370 nm處有明顯的最大吸收，而在480 nm，象征紅色素的特征峰不明顯，且吸收值較小．因而整個(gè)色素提取液呈現(xiàn)黃色調(diào)．本實(shí)驗(yàn)采用370 nm作為水溶性紅曲色素的檢測波長，與Yongsmith等［9］獲得的紅曲霉突變株所產(chǎn)黃色素吸收峰一致．

圖1 水溶性紅曲色素的紫外可見光吸收光譜

2．2 超聲波輔助提取水溶性紅曲色素的單因素實(shí)驗(yàn)

2．2．1 超聲時(shí)間

在液料比為20∶1，超聲功率為400 W的條件下，考察了不同的超聲波作用時(shí)間對水溶性紅曲色素提取液色價(jià)的影響．由圖2可以看出:在作用時(shí)間為5～20 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，提取液的色價(jià)呈直線上升趨勢;當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，色價(jià)達(dá)到一個(gè)較高的水平;之后，隨著提取時(shí)間的延長，色價(jià)變化不明顯．這可能是由于隨著超聲時(shí)間的延長，溶劑體系的滲透壓達(dá)到平衡，水溶性紅曲色素?zé)o法繼續(xù)隨著溶劑向細(xì)胞外擴(kuò)散，從而表現(xiàn)為提取液的色價(jià)保持穩(wěn)定．綜上，本著提高色價(jià)和縮短提取時(shí)間的目的，將水溶性紅曲色素提取的最適超聲時(shí)間確定為20 min．

圖2 超聲時(shí)間對水溶性紅曲色素提取液色價(jià)的影響

2．2．2 液料比

在超聲時(shí)間為20 min，超聲功率為400 W的條件下，考察了不同的液料比對水溶性紅曲色素提取液色價(jià)的影響．由圖3可以看出:隨著溶劑體積的增大，提取液的色價(jià)在初期有明顯的提高;當(dāng)液料比達(dá)到30∶1時(shí)，色價(jià)達(dá)到較高的水平;之后，隨著液料比的增大，色價(jià)反而有所降低．這可能是由于溶劑體積的增加使紅曲米顆粒與溶劑的接觸界面增大，從而提高了傳質(zhì)的效率;當(dāng)液料比繼續(xù)增大時(shí)，由于溶劑的增加，超聲波作用產(chǎn)生的能量被分散，攪拌不夠充分，反而造成了提取效果的下降．因此，對液料比的較佳取值為30∶1．

圖3 液料比對水溶性紅曲色素提取液色價(jià)的影響

2．2．3 超聲功率對紅曲色素提取的影響

在超聲時(shí)間為20 min，液料比為30∶1的條件下，考察了不同的超聲波功率對水溶性紅曲色素提取液色價(jià)的影響．由圖4可以看出:隨著超聲功率的增大，提取液的色價(jià)呈現(xiàn)上升的趨勢;當(dāng)超聲功率為700 W時(shí)，色價(jià)達(dá)到一個(gè)較高的水平;之后，繼續(xù)提高超聲功率，色價(jià)反而有所下降．這可能是由于超聲功率過高，超聲波對紅曲米的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞作用，體系中有微小的淀粉顆粒析出并吸附了部分色素分子，這一部分色素在冷凍離心過程中被沉淀，從而造成提取液的色價(jià)降低［10］．值得注意的是，當(dāng)超聲功率升高到900 W時(shí)，提取液中有油狀物，影響了色價(jià)的測定，這可能是由于超聲功率過高造成了紅曲米中油脂析出．另外，過于強(qiáng)烈的機(jī)械振動(dòng)也可能使色素的構(gòu)象發(fā)生改變，造成了提取液色價(jià)的下降．

圖4 超聲功率對水溶性紅曲色素提取液色價(jià)的影響

2．3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2．3．1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

利用軟件 Design Expert 6．0的 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，對超聲時(shí)間、液料比和超聲功率設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見表2．通過Design Expert 6．0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行了回歸分析，擬合后得到超聲時(shí)間(A)、液料比(B)和超聲功率(C)的二次多項(xiàng)式回歸模型

對上述回歸模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果(見表3)表明該回歸模型極顯著(P=0．000 3＜0．01)．回歸模型的決定系數(shù) R2=0．988 3，校正決定系數(shù)R2Adj=0．967 2，失擬項(xiàng) P=0．172 9 ＞0．05，不顯著，說明該回歸模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用該模型分析和預(yù)測超聲波輔助提取水溶性紅曲色素的工藝結(jié)果．回歸模型中的一次項(xiàng)均顯著，二次項(xiàng)均為極顯著，交互項(xiàng)AB和BC顯著，表明各影響因素對提取液色價(jià)的影響并不是簡單的線性關(guān)系．3個(gè)因素中對提取結(jié)果影響最大的為液料比，其次為超聲功率，影響程度最小的為超聲時(shí)間．

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析數(shù)據(jù)

圖5 超聲時(shí)間與液料比對水溶性紅曲色素提取液色價(jià)影響的響應(yīng)面和等高線

圖6 超聲時(shí)間與超聲功率對水溶性紅曲色素提取液色價(jià)影響的響應(yīng)面和等高線

圖7 液料比與超聲功率對水溶性紅曲色素提取液色價(jià)影響的響應(yīng)面和等高線

2．3．2 超聲波輔助提取條件分析與優(yōu)化

多元回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖5～圖7，通過這組動(dòng)態(tài)圖即可對任何兩因素之間交互影響的效應(yīng)進(jìn)行分析和評價(jià)，并從中確定最佳的因素水平范圍．響應(yīng)面是響應(yīng)值對各實(shí)驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響越大，表現(xiàn)為曲面越陡峭．等高線的形狀則可以反映兩兩因素之間交互作用的顯著程度．圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反．

由圖5～圖7的等高線可以直觀地看出，超聲時(shí)間與液料比、超聲功率與液料比對提取液的色價(jià)有著顯著的交互作用，而超聲時(shí)間和超聲功率對提取液色價(jià)的交互作用不太顯著，各因素與水溶性紅曲色素提取液色價(jià)的關(guān)系均可清晰地看出．根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert 6．0軟件獲得了提取液色價(jià)最高時(shí)的最佳超聲波輔助提取條件:超聲時(shí)間為20．63 min，液料比為32．15 ∶1，超聲功率為726．73 W．在此優(yōu)化條件下，水溶性紅曲色素提取液的色價(jià)理論值為571．769 U/g．考慮到實(shí)際操作的情況，在超聲時(shí)間為20．6 min，液料比為32 ∶1，超聲功率為730 W的條件下，進(jìn)行了5次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)．5 次實(shí)驗(yàn)的提取液色價(jià)分別為571．5，568．8，572．7，565．5，574．0 U/g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提取液色價(jià)的均值為570．5 U/g，與理論預(yù)測值誤差僅為0．2%．說明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)較為可信，利用超聲波輔助方法提取紅曲米中水溶性色素具有一定的可行性與應(yīng)用價(jià)值．

3 結(jié)論

紅曲米中包含多種色素成分，工業(yè)上對紅曲米中紅曲色素的提取溶劑采用70%乙醇，提取液中成分復(fù)雜，大部分為親水性差的醇溶性色素，這在一定程度上限制了紅曲色素的推廣使用．本實(shí)驗(yàn)利用超聲波產(chǎn)生的脈沖作用，以水為溶劑，對紅曲米中的水溶性色素進(jìn)行了提取，提取殘?jiān)€可采用常規(guī)方法二次提取醇溶性色素．本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法提取的水溶性紅曲色素在370 nm處有明顯的吸收峰，具有黃色素特征．通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取紅曲米中的水溶性色素，得到一個(gè)二次多項(xiàng)式回歸模型(R2=0．988 3)，模型擬合度良好．回歸模型的方差分析結(jié)果表明，各因素對超聲波輔助提取色素的影響大小依次為:液料比＞超聲功率＞超聲時(shí)間．最終確定的超聲波輔助提取紅曲米中水溶性色素的最佳工藝條件為:超聲時(shí)間20．6 min，液料比32 ∶1，超聲功率730 W．經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該優(yōu)化條件下水溶性紅曲色素提取液的色價(jià)為570．5 U/g．利用超聲波輔助提取法可以有效地分離提取紅曲米中的水溶性色素，最終獲得的色素色價(jià)較高，且具有提取時(shí)間短的特點(diǎn)，避免了光敏性紅曲色素因長時(shí)間暴露在外而造成的損失［11］．

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