microRNA的研究進展

郝克紅，段 濤(綜述)，王 凱，周 倩(審校)

(同濟大學附屬第一婦嬰保健院產科，上海200040)

到目前人類基因組中已經確定的微小核糖核酸(microRNA，miRNA)有650個以上，它們參與調控人類30%的蛋白質的表達。通過與目的基因翻譯結合，抑制靶基因表達，從而參與到多種生物學過程中，調節生物體的發育，調控生物體的生理穩態，并參與疾病的發生和調節。基于miRNA所產生的多種多樣的生物學功能，近年來對miRNA的研究成為科學研究的熱點之一。通過不斷探索，人們正在逐漸深入地揭示miRNA功能及其意義。

1 miRNA的概述

Lee等［1］于1993年在線蟲中發現了控制幼蟲時序性發育的分子lin-4，lin-4的突變體不能順利發育或者發育延遲。進一步研究發現該基因產物不編碼任何前體，轉錄產物為莖環結構，它與特定的mRNA 3'端非翻譯序列互補而抑制此mRNA的翻譯。隨后在線蟲中發現了具有類似結構的let-7［2］。隨著分子生物學技術的發展，越來越多的miRNA被發現。

miRNA的成熟經歷以下階段。第一階段:RNA聚合酶Ⅱ轉錄 miRNA基因，產物為具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA。第二階段:pri-miRNA在核內被RNaseⅢDrosha切割加工成約70個核苷酸組成的miRNA前體pre-miRNA。第三階段:pre-miRNA在Ran-GTP依賴的核質/細胞質轉運蛋白exportin5的作用下，從核內運輸到胞質中，莖環結構被Dicer酶切割成約22個核苷酸長度的雙鏈的miRNA，即miRNA*配對分子(miRNA*是miRNA的互補序列)，然后解鏈產生成熟的miRNA分子，單鏈的miRNA與RNA介導的沉默復合體結合后形成復合物，稱為miRNP，miRNA通過與靶基因的3'端非翻譯區互補配對，指導miRNP復合體對靶基因mRNA進行切割或者翻譯抑制。

2 miRNA調節生物體發育

miRNA通過轉錄后水平調控蛋白質的合成參與各種生命過程。Wienholds等［3］報道miRNA在斑馬魚胚胎發育過程中呈現空間性和時序性的動態表達模式。近年來關于miRNA與組織器官形成的報道不斷出現，包括心臟、血管、肌肉、肺、腎臟、胰腺、皮膚、牙齒、內耳、腦、造血系統等。現以miRNA在血管和腦形成發育中的作用為例闡述。

Yang等［4］對 Dicer基因突變小鼠研究揭示了miRNA在胚胎血管形成中的重要作用。Suarez等［5］觀察發現內皮細胞Dicer基因特異性剔除的小鼠對形成血管的刺激反應降低，為內皮miRNA影響血管生成提供了體內研究證據。miR-221/222的靶基因C-kit的編碼產物是干細胞因子的酪氨酸激酶受體，它可以促進人臍靜脈內皮細胞的生存、遷移和小管樣結構形成［6］。Wang等［7］發現內皮細胞特異性miR-126調節血管發生和發育，靶向刪除miR-126基因的小鼠血管完整性缺失，內皮細胞功能發生缺陷，進而導致血管滲漏、出血、甚至胚胎期死亡。進一步研究發現miR-126靶基因產物Spred-1是一種細胞內血管生成信號抑制劑，它負調控Ras/絲裂原活化蛋白激酶信號通路，從而影響血管內皮生長因子和成纖維細胞生長因子的水平，導致血管發育異常。此外，miR-210、miR-21、miR-31等眾多miRNA均參與血管生成調控［8］。

Dicer基因突變的斑馬魚胚胎由于成熟miRNA生成障礙導致多種缺陷，包括腦形態缺陷。突變胚胎的前、中、后腦和脊髓可以辨認，但精細結構嚴重受損，而當給予突變胚胎miR-430時可以有效挽救大腦的表型［9］。Visvanathan等［10］發現，由神經祖細胞向神經元分化過程中SCP1、核纖層蛋白、整合蛋白表達下降，而miR-124正是通過抑制這些靶基因的表達促進神經元分化。Cheng等［11］研究發現，miRNA還可以調控成人短暫的神經發生過程，miR-124調節轉錄因子Sox9的表達參與這一過程。此外，很多研究也證實了miRNA對腦發育的調控作用［12］。

3 miRNA和疾病發生的關系

miRNA與多種疾病的發生、發展密切相關，已經有關于其與心臟病、肌營養不良、糖尿病、肝炎、惡性腫瘤、帕金森病、唐氏綜合征等疾病相關的研究證據。2002年，miRNA與腫瘤的關系首次在慢性淋巴細胞白血病中報道［13］，此后miRNA在人類惡性腫瘤中的異常表達成為近年來研究的熱點之一。現從婦科腫瘤方面介紹miRNA對腫瘤發生的調控作用。Iorio等［14］對上皮性卵巢癌的miRNA表達譜進行檢測，發現miR-200a、miR-141、miR-200c、miR-200b表達過量，而miR-199a、miR-140、miR-145、miR-125b1表達降低。miRNA基因的去甲基化作用導致其異常表達。Zhang等［15］研究發現，基因丟失與表觀遺傳學變化均與卵巢癌組織miRNA表達下調有關。較之早期腫瘤組織，晚期腫瘤中miRNA的表達下調作用更為明顯，并證實miR-15a、miR-34a、miR-34b為腫瘤抑制分子。Giannakakis等［16］發現64%的卵巢癌患者的miR-210基因拷貝數下降，表達水平降低，表明該基因可能具有腫瘤抑制作用。Boren等［17］發現13個miRNA和90個mRNA與子宮內膜癌的形成有關，進行通路分析證實其中26個mRNA基因涉及細胞死亡、生長、增殖和腫瘤形成過程。子宮漿液性癌細胞轉染miR-101和miR-152前體可以抑制細胞生長，而兩者在癌組織中的表達顯著下調［18］。有研究證明，miR-129通過抑制靶基因CDK6調控細胞增殖，而miR-129在子宮內膜癌組織中的表達是下調的［19］。還有研究證實，miR-9、miR-27、miR-96等抑制抑癌基因FOXO1的表達，從而促進子宮內膜癌的發生［20］。這些研究都表明miRNA在子宮內膜癌的發生中發揮重要作用。

4 一種新的生物標志物——miRNA

miRNA調控人類的生長發育、生理、病理狀態。體液中廣泛存在的miRNA可能成為人類生理和疾病狀態的新的有效生物標志物。正常組織與病理組織中miRNA表達水平存在差異，即使是同一組織不同的分化時期，miRNA水平也不相同。這種差異表達也發生在腫瘤特異性miRNA上，從而幫助診斷腫瘤的組織來源和特定的腫瘤分型。越來越多的證據支持miRNA作為人類腫瘤的生物學標志物。Mitchell等［21］研究發現，檢測血清miR-141水平可以區分前列腺癌患者與正常人。Ueda等［22］分析了160對胃癌和正常黏液樣本，發現胃癌病例中22個miRNA升高，13個降低，292例樣本都可以由miRNA的差異表達精確區分。另外，miRNA在兩種胃癌亞型中也呈現差異表達。miRNA不僅可以作為診斷標志物，一些miRNA表達水平還與腫瘤預后密切相關。Gallardo等［23］發現miR-34a可作為非小細胞肺癌的預后標志物。Diaz等［24］的研究發現，miR-106a可作為不依賴臨床分期的結腸癌無病生存率和全面生存率標志物。

5 胎盤miRNA與疾病發生的關系

自證實miRNA在胎盤組織的廣泛及組織特異性表達以來，許多研究者將興趣投向miRNA對胎盤基因表達的調控及病理狀態下胎盤miRNA的差異性表達。Montenegro等［25］比較早產和足月產絨毛膜羊膜上miRNA表達譜發現，足月時31個miRNA表達水平下降。進一步研究發現，足月時絨毛膜羊膜上miRNA成熟的關鍵酶 Dicer表達水平顯著下降。Pineles等［26］揭示了miR-210和miR-182在子癇前期胎盤和正常胎盤的表達差異，分析發現miR-210的靶基因多涉及轉錄后調控，miR-182靶基因多與細胞凋亡有關，為進一步研究子癇前期的病理過程提供了新的方向。最近一項研究證實子癇前期胎盤miR-155表達水平升高，并通過下調編碼血管生成調控因子的靶基因CYR61促進子癇前期的發生［27］。氧水平通過影響胎盤的生長和功能影響胎兒的發育、生存和疾病狀態。Mouillet等［28］研究發現，胎盤損傷和低灌注導致滋養細胞暴露于缺氧環境時，miR-93、miR-205、miR-224、miR-335、miR-451與正常狀態相比呈現高表達，而miR-424呈低表達狀態。對其靶基因進行分析發現，miR-205靶基因MED1編碼的輔轉錄激活因子在胎盤形成中發揮重要作用，而缺氧時miR-205通過沉默MED1促進滋養細胞損傷。Mouillet等［29］的另外一項研究發現，與正常妊娠相比，伴有胎兒生長受限的妊娠婦女血清中與缺氧相關的胎盤miRNA總水平是正常妊娠婦女的1.84倍，而胎盤上的表達水平卻下降24%。最近研究發現，母親孕期抽煙和胎盤細胞雙酚A暴露都會導致胎盤miRNA表達發生改變［30，31］。

6 小結與展望

RNA是生物體內最總要的物質之一，而長久以來它僅僅被認為是DNA和蛋白質之間的過渡物質。自第一個miRNA發現以來，這種全新的、非編碼的、多物種之間高度保守表達的小RNA即成為各生命科學領域學者的研究焦點。隨著分子生物學技術的發展，越來越多的miRNA不斷被發現，它們的作用機制、功能在生物體發育和疾病發生、發展中的作用越來越深入地被闡明。胎盤miRNA在病理狀態下差異表達及其在產科疾病中的作用也被逐步研究和認識。胎盤作為維持妊娠和胎兒發育的重要器官，妊娠期間其結構和功能處于不斷變化之中，而miRNA對胎盤血管發生、結構形成及分泌功能等的調控作用尚不清楚。研究miRNA在胎盤發育過程中的作用可能有助于闡明胎盤相關疾病的病因和病理生理過程，從而為預防和治療提供新的線索。

［1］ Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］.Cell，1993，75(5):843-854.

［2］ Reinhart BJ，Slack FJ，Basson M，et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，2000，403(6772):901-906.

［3］ Wienholds E，Kloosterman WP，Miska E，et al.MicroRNA expression in zebrafish embryonic development［J］.Science，2005，309 (5732):310-311.

［4］ Yang WJ，Yang DD，Na SQ，et al.Dicer is required for embryonic angiogenesis during mouse development［J］.J Biol Chem，2005，280(10):9330-9335.

［5］ Suarez Y，Fernandez-Hernando C，Pober JS，et al.Dicer dependent microRNAs regulate gene expression and functions in human endothelial cells［J］.Circ Res，2007，100(8):1164-1173.

［6］ Matsui J，Wakabayashi T，Asada M，et al.Stem cell factor/c-kit signaling promotes the survival，migration，and capillary tube formation of human umbilical vein endothelial cells［J］.J Biol Chem，2004，279(18):18600-18607.

［7］ Wang S，Aurora AB，Johnson BA，et al.The endothelial-specific microRNA miR-126 governs vascular integrity and angiogenesis［J］.Dev Cell，2008，15(2):261-271.

［8］ Wang S，Olson EN.AngiomiRs-Key regulators of angiogenesis［J］.Curr Opin Genet Dev，2009，19(3):205-211.

［9］ Giraldez AJ，Cinalli RM，Glasner ME，et al.MicroRNAs regulate brain morphogenesis in zebrafish［J］.Science，2005，308(5723): 833-838.

［10］ Visvanathan J，Lee S，Lee B，et al.The microRNA miR-124 antagonizes the anti-neural REST/SCP1 pathway during embryonic CNS development［J］.Gene Dev，2007，21(7):744-749.

［11］ Cheng LC，Pastrana E，Tavazoie M，et al.MiR-124 regulates adult neurogenesis in the subventricular zone stem cell niche［J］.Nat Neurosci，2009，12(4):399-408.

［12］ Saba R，Schratt GM.MicroRNAs in neuronal development，function and dysfunction［J］.Brain Res，2010，1338:3-13.

［13］ Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al.Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(24):15524-15529.

［14］ Iorio MV，Visone R，Di Leva G，et al.MicroRNA signatures in human ovarian cancer［J］.Cancer Res，2007，67(18):8699-8707.

［15］ Zhang L，Volinia S，Bonome T，et al.Genomic and epigenetic alterations deregulate microRNA expression in human epithelial ovarian cancer［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(19):7004-7009.

［16］ Giannakakis A，Sandaltzopoulos R，Greshock J，et al.MiR-210 links hypoxia with cell cycle regulation and is deleted in human epithelial ovarian cancer［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(2):255-264.

［17］ Boren T，Xiong Y，Hakam A，et al.MicroRNAs and their target messenger RNAs associated with endometrial carcinogenesis［J］.Gynecol Oncol，2008，110(2):206-215.

［18］ Hiroki E，Akahira J，Suzuki F，et al.Changes in microRNA expression levels correlate with clinicopathological features and prognoses in endometrial serous adenocarcinomas［J］.Cancer Sci，2010，101 (1):241-249.

［19］ Wu J，Qian J，Li C，et al.MiR-129 regulates cell proliferation by downregulating Cdk6 expression［J］.Cell Cycle，2010，9(9): 1809-1818.

［20］ Myatt SS，Wang J，Monteiro LJ，et al.Definition of microRNAs that repress expression of the tumor suppressor gene FOXO1 in endometrial cancer［J］.Cancer Res，2010，70(1):367-377.

［21］ Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(30):10513-10518.

［22］ Ueda T，Volinia S，Okumura H，et al.Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer:a microRNA expression analysis［J］.Lancet Oncol，2010，11(2): 136-146.

［23］ Gallardo E，Navarro A，Vinolas N，et al.MiR-34a as a prognostic marker of relapse in surgically resected non-small-cell lung cancer［J］.Carcinogenesis，2009，30(11):1903-1909.

［24］ Diaz R，Silva J，Garcia JM，et al.Deregulated expression of miR-106a predicts survival in human colon cancer patients［J］.Gene Chromosome Canc，2008，47(9):794-802.

［25］ Montenegro D，Romero R，Kim SS，et al.Expression patterns of microRNAs in the chorioamniotic membranes:a role for microRNAs in human pregnancy and parturition［J］.J Pathol，2009，217(1): 113-121.

［26］ Pineles BL，Romero R，Montenegro D，et al.Distinct subsets of microRNAs are expressed differentially in the human placentas of patients with preeclampsia［J］.Am J Obstet Gynecol，2007，196(3): 261.e1-e6.

［27］ Zhang Y，Diao Z，Su L，et al.MicroRNA-155 contributes to preeclampsia by down-regulating CYR61［J］.Am J Obstet Gynecol，2010，202(5):466.e1-e7.

［28］ Mouillet JF，Chu T，Nelson DM，et al.MiR-205 silences MED1 in hypoxic primary human trophoblasts［J］.Faseb J，2010，24(6): 2030-2039.

［29］ Mouillet JF，Chu T，Hubel CA，et al.The levels of hypoxia-regulated microRNAs in plasma of pregnant women with fetal growth restriction［J］.Placenta，2010，31(9):781-784.

［30］ Maccani MA，Avissar-Whiting M，Banister CE，et al.Maternal cigarette smoking during pregnancy is associated with downregulation of miR-16，miR-21 and miR-146a in the placenta［J］.Epigenetics，2010，5(7):583-589.

［31］ Avissar-Whiting M，Veiga KR，Uhl KM，et al.Bisphenol A exposure leads to specific microRNA alterations in placental cells［J］.Reprod Toxicol，2010，29(4):401-406.