骨組織脫鈣技術及其應用

張緒斌 熊正文 張華東

解放軍第251醫院,河北省張家口市 075000

骨組織不同于一般的軟組織,是一種堅硬的結締組織,由粘多糖和一些膠原纖維樣骨膠纖維構成的骨樣組織和沉著于其中的無機鹽(骨鹽)形成的。無機鹽以羥基磷灰石結晶的形式存在,其中絕大部分為水合磷酸鈣,此外還包括微量碳酸鹽和檸檬酸鹽等[1,2],因此骨和其他一些已鈣化的組織在脫水、透明等制片前必須將組織中的鈣鹽用脫鈣劑除去,才能制成4～5μm厚的切片。目前,常用的脫鈣劑主要有單純酸類、混合酸類、螯合劑、離子交換樹脂和電解脫鈣等方法[3～6],尤其是近年來應用微波技術輔助脫鈣明顯縮短了脫鈣時間,改善了HE、組織化學、免疫組織化學染色和原位雜交[7～11]?，F將骨組織的脫鈣技術及應用等有關內容簡介如下。

1 骨組織的組織學特點[1,2]

骨組織由骨基質和骨細胞組成,骨基質是由有機物質和無機物質緊密結合而成,主要成分有:(1)膠原纖維:為Ⅰ型膠原;(2)粘蛋白:為膠原纖維間的無定型物質;(3)骨鹽:主要是羥基磷灰石;(4)酶:包括堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和膠原酶等。軟骨基質是由軟骨母細胞分泌豐富的蛋白多糖組成的,HE染色呈淡藍色,A lcian藍染色陽性(藍色),甲苯胺藍呈異染性反應(紫紅色),軟骨的膠原屬Ⅱ型膠原。

骨及軟骨的細胞成分有:(1)骨母細胞,其形態與靜止及活躍狀態有關,前者呈梭形;后者常為多邊形或橢圓形。胞體大、核偏位、胞漿豐富、嗜堿性。骨母細胞能產生骨樣基質,由骨樣基質與其周邊的骨母細胞構成了骨樣組織,HE染色呈粉紅;(2)骨細胞位于骨陷窩內,常呈小梭形;(3)軟骨母細胞,胞體為卵圓形,常伴隨軟骨基質而存在;(4)破骨細胞(Osteoclast)為一種多核巨細胞,可有10～20個核,核淡染,有核仁,胞漿嗜酸有突起,電鏡下可見微絨毛,破骨細胞含有豐富的酸性磷酸酶和膠原酶。

2 骨組織的固定

由于骨組織致密、堅硬,并含有骨膠等成分,所以骨組織的固定、脫水、透明、包埋等都很困難。不論是HE染色、組化染色,還是免疫組織化學染色都要求將組織及時固定,其目的是為了保存良好的組織形態結構、防止組織自溶,阻止內、外源性細胞內分解酶活性和保存某些特殊抗原[1,12]。骨組織固定的方法主要有先固定后脫鈣、固定脫鈣同時進行和先脫鈣后固定三種方式[13]。

常用的固定劑主要有福爾馬林、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇及碳化二亞銨等,它們都具有良好的固定作用。固定不當對抗原性有很大的影響,主要表現在三個方面,一是組織過大固定時間不夠,使組織中心部位的抗原溶解、彌散或丟失;二是在福爾馬林固定時間過長,因醛-氨基交聯而降低抗原性;三是固定液的種類、濃度和溫度對一些特殊抗原有很大的破壞作用[1,12]。離體組織應采用10%的福爾馬林或4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4)及時浸泡固定,也可用120～150W 的微波(microwave,MW)輔助固定液、或生理鹽水固定3～5m in,組織塊的大小以1.2cm×0.8cm×0.2cm為好,需電鏡檢查的材料可加入0.05%～0.5%的戊二醛[2]。

3 骨組織的常用脫鈣方法及脫鈣液

3.1 單純酸類脫鈣劑 主要有甲酸、硝酸、鹽酸、三氯乙酸和硫酸等,尤其是甲酸和硝酸在骨組織的脫鈣中應用較其他單純酸多[9,13]。甲酸又稱蟻酸,是一種良好的常規脫鈣劑,其作用緩慢,對組織損害小,使用濃度5%～50%,濃度越高、脫鈣時間越短,使用時應隨時注意觀察[9,13]。通過對比5%、8%、10%和13%硝酸脫鈣液的濃度,以8%～10%濃度的硝酸,脫鈣效果最好。8%硝酸室溫下脫鈣骨密質需要24～36h,骨松質需要12～24h,蠟塊中的組織塊及切片均呈淡黃色,陽性免疫組織化學染色極差,背景較深。硝酸是臨床病理活檢中最實用的一種常規脫鈣劑,脫鈣迅速、完全可靠、作用強、時間短、效果好,但是對骨組織的破壞作用較大[13]。采用低溫MW-8%硝酸脫鈣骨密質需要50～55min,骨松質需要30～35m in,其石蠟切片完整、HE染色對比好,IHCS標記陽性細胞比室溫條件下硝酸脫鈣的多、著色深、背景最淡[5,6,9]。使用硝酸脫鈣時由于亞硝酸形成使組織呈黃色而影響其后的染色,在室溫條件下更明顯,在純硝酸中加入0.1%的尿素可防止變黃。

3.2 混合酸類脫鈣劑 混合酸類脫鈣液是指兩種酸類脫鈣劑一起使用,或在單純酸內加入另一種脫鈣劑或少量的其他試劑所配制的脫鈣液,這類脫鈣液的特點是脫鈣完全、快速,防止纖維組織過度膨脹,減少組織破壞及對染色的影響。通過加入不同的化學成分可以彌補單純酸類脫鈣液的不足,所以混合酸類脫鈣液越來越受到人們的歡迎。常用的混合酸類脫鈣液主要有甲酸-甲醛脫鈣液、甲酸-檸檬酸鈉液、Schm orl's液、Von Ebner氏液、Jenkins氏液、Plank-Rycho 氏液、Richman 氏液、Jy-Ⅰ 、Jy-Ⅱ氏液、Schcidde氏液等[9,13]。

3.3 螯合劑脫鈣技術 螯合劑屬于有機化合物,因其可與金屬離子結合而把它作為脫鈣劑使用,如乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、檸檬酸鈉等。檸檬酸鈉對組織損害較大、產生氣泡、脫鈣時間長,所以很少使用。EDTA具有對組織破壞小、不產生氣泡、不影響染色、pH值近中性等優點,所以使用較多。在4%、7%、10%、13%和16%EDTA脫鈣液濃度中,以10%、13%濃度的脫鈣效果最好。室溫下使用EDTA脫鈣(20℃),骨密質需要 35～40d,骨松質需要30～35d,石蠟切片完整,HE染色對比好,IHCS陽性細胞數量多、著色深、背景淡。低溫MW-10%EDTA脫鈣,骨密質需要9～10h,骨松質需要7～8h,石蠟切片、HE及IHCS比室溫條件下脫鈣好、時間明顯縮短[1,10,14]。

3.4 離子交換樹脂技術 離子交換樹脂脫鈣是一種非常理想的脫鈣技術,它能使脫鈣液中的鈣離子快速除去,確保骨組織中鈣能充分地、通暢地溶出,以最大程度地提高脫鈣液的效率,加速脫鈣速度,縮短脫鈣時間,為HE、組化和免疫組化染色提供有利條件。其方法是將氨型磺化聚苯乙烯樹脂鋪在脫鈣容器底部厚度約1.5cm,將脫鈣組織放在樹脂上面,加入有機酸(不可加入無機酸)脫鈣液,脫鈣液的用量為脫鈣組織體積的20～30倍[13]。

3.5 電解脫鈣技術 電解脫鈣是將兩電極插入脫鈣液中,使脫鈣液內有電流通過,將脫鈣液中的鈣離子吸引到陰極而發生電離作用,加速脫鈣過程、縮短脫鈣時間,尤其是大量標本脫鈣或是標本體積大時效果更好。電解脫鈣的原理是在容器內裝脫鈣液150m l,取一根鉑金絲將標本纏繞數圈,放在容器一側,鉑金絲另一端連接電源正極,在容器另一側,將一支鋼片或炭精棒的下端插入電解脫鈣液內,上端與電源負極相接,在正、負極之間隔置一塊絕緣的有機玻璃或塑料板,以防電極接觸而引起導電,將已裝好的導電裝置置于37～45℃恒溫水浴箱中,接通電源即可脫鈣。此方法簡便易行,染色效果好,一般數分鐘至數小時即可完成脫鈣[3]。

3.6 脫鈣機脫鈣技術 近年來隨著科學技術的不斷發展,骨組織的脫鈣技術也有了新的發展,利用超聲波、電離等技術生產的脫鈣機也應運而生,但由于經濟狀況和技術條件的限制,目前國內大部分實驗室都還不具備這種設備。脫鈣機脫鈣技術尚不十分完善,目前國外的脫鈣機主要為加熱恒溫法、超聲波法、電離法、真空負壓法等,但這些方法都需要酸類脫鈣劑參與,脫鈣液對組織形態結構、抗原性的破壞,對染色的影響還是不可避免。脫鈣機加快了脫鈣速度,縮短了脫鈣時間,減少了長時間脫鈣對組織形態結構、抗原性等的損害,使脫鈣效果更好,解決了人工無法解決的許多技術難題[13]。

4 骨組織的低溫-微波快速脫鈣技術研究

4.1 微波特性生物物理學持性與應用 MW是一種高頻電磁波,頻率為300～300 000MHz,波長1mm～1m,生物醫學中常用的頻率為 2 450、915、434MHz,目前微波爐所用頻率為2 450MH z,波長12.5cm。MW的透入深度與頻率成反比,與波長成正比,頻率高,波長短,其輻射方向性好,能量易于集中,但透入深度小;反之則方向性差,能量不易于集中,透入深度大。MW與光波不同,屬于非電離輻射,不能使鍵能最弱的氫鍵斷裂。當MW作用于生物體或介質時,因吸收MW而使溫度升高,發生熱效應。MW不發生熱傳遞,熱效應產生的多少與生物體內的水分、介質中的極性分子或離子濃度等成正比。MW產熱的原理是排列混亂的極性分子、離子等在電場力的作用下使它們振動、運動、相互摩擦、碰撞,而產生熱量,使組織細胞或介質的溫度升高[2,15]。

自從MW首次用于固定動物實驗材料獲得成功,隨后大量的研究結果證實,MW在常規制片、冰凍切片、組化、免疫組化、原雜交和電鏡制片等領域均獲得了十分好的效果[2,8,11,16]。國內外文獻對臨床病理活體檢查骨組織的脫鈣及脫鈣液有較多的研究,但對IHCS所用材料的研究較少,國外學者在內耳的免疫組化研究中使用EDTA脫鈣獲得了較好的效果,但所需時間長達3～4周,有的甚至需數月(4～7個月),很難滿足臨床活檢病理診斷和研究的需要[10,17]。

4.2 骨組織的低溫-微波快速脫鈣技術研究 根據MW熱效應的原理,在對脫鈣液的種類、脫鈣溫度等進行較深入研究的基礎上,將MW與硝酸、EDTA等脫鈣液相結合,創用的“低溫MW-快速脫鈣技術”,使脫鈣組織的組織形態結構、抗原性均得到了很好的保存,而且脫鈣時間顯著縮短,在骨腫瘤和內耳等的IHCS中收到了很好的效果[1,11,17]。研究結果顯示[1,2,18,19]:(1)鈣液的溫度對IHCS結果有十分明顯的影響,低溫條件下脫鈣對抗原性有很好的保護作用;(2)脫鈣液的種類對抗原性無明顯影響;(3)將低溫微波技術與硝酸、甲酸和EDTA等脫鈣方法結合,由于縮短了脫鈣時間,使抗原性得到了很好的保存;(4)合理使用抗原修復技術可以使石蠟切片或冰凍切片的抗原性得到很好的恢復;(5)石蠟切片比冰凍切片能更好的保護組織形態結構。

4.3 低溫MW-硝酸快速脫鈣的方法[2,6,14](1)取4～5個月齡豚鼠耳蝸、家兔的后腿骨及骨腫瘤等待脫鈣的骨及脫化組織,大小為 l.2cm×0.8cm×0.4cm,用10%福爾馬林固定12h、流水沖洗0.5～1h。(2)在1 000m l的大燒杯內放500m l冰水。(3)在500m l的小燒杯內放250m l經冰箱預冷的硝酸或EDTA脫鈣液,然后放待脫鈣的組織。(4)將小燒杯放入大量杯內,然后一同放入微波爐中。(5)用2檔(微波輸出功率250W)脫鈣,并測量大、小燒杯中液體的溫度。當接近15℃時向大燒杯中添加冰塊,或向小燒杯中添加預冷的脫鈣液,這樣脫鈣液溫度不會迅速升高,又發揮了微波效應的作用,保證了脫鈣液的溫度始終控制在15℃以內。低溫MW-硝酸快速脫鈣技術的關鍵是通過脫鈣液在冰箱中預冷、及時更換脫鈣液和在裝脫鈣液容器之外的大容器中添加冰塊,使脫鈣液不至于因為微波熱效應的作用而使溫度迅速升高。

5 脫鈣方法的對比研究

1993年Walsh等[7]對硝酸、蟻酸和EDTA 脫鈣的組織進行了m RNA原位雜交,他認為蟻酸和EDTA比硝酸能真實反應組織中m RNA實際含量。Shibata等[8]研究了 10%硝酸、10%鹽酸、5%蟻酸、5%三氯醋酸、M orse液、Plank-Rycho氏液和K-CX液共7種脫鈣液對rRNA原位雜交染色效果的影響,結果顯示5%蟻酸和 M orse液最好。Yam am oto-Fuku等[9]也用DNA組織化染色和原位末端缺口標記評價了 10%EDTA、5%三醋酸、Morse液、5%蟻酸、5%鹽酸、10%硝酸、Plank-Rycho氏液和K-CX液共8種脫鈣液的脫鈣效果,結果顯示 10%EDTA、5%三氯醋酸、M orse液和5%蟻酸可用于DNA組織化學染色;10%EDTA、5%蟻酸可用于DNA原位末端缺口標記,而其他脫鈣液均不行。有學者通過對8%硝酸、甲酸-甲醛混合液、20%甲酸液、Jenkins液、10%EDTA 5種脫鈣液分別在低溫微波15℃組(Ⅰ組)、冰箱4℃(Ⅱ組)、室溫20℃(Ⅲ組)和溫箱37℃(Ⅳ組)條件下脫鈣的對比,免疫組織化學染色、圖像分析檢測ANP、5-H T 、S-100、NF、GFAP 和 Vimentin 的染色。結果以硝酸作為脫鈣劑時,Ⅰ組(1.89+0.97)陽性細胞的光密度值與Ⅱ組(1.81+1.02)相近,均顯著高于Ⅲ(1.03+0.85)、Ⅳ(0.76+0.85)組;脫鈣液的溫度越高,陽性細胞的光密度值越低,脫鈣時間越短。研究結果證實低溫-MW硝酸脫鈣技術能夠在較短時間內獲得滿意的IHCS染色效果[18～20]。

6 骨組織脫鈣的注意事項

骨組織脫鈣應注意以下幾點[1,9,13,18～20]:(1)脫鈣時間應根據所用的脫鈣劑不同種類;不同的骨組織、骨密質、骨松質和組織塊的大小等具體情況而確定脫鈣時間。(2)低溫-MW脫鈣的關鍵是保持脫鈣液的溫度始終控制在15℃以內,盡量減少脫鈣液溫度過高等人為因素對組織結構、抗原性等的破壞作用。(3)骨組織取材不宜過厚,一般應在5mm左右,以負脫鈣時間過長造成組織形態結構破壞和染色效果不佳。(4)脫鈣容器不能使用金屬制品,而且脫鈣液的用量要充足,一般為標本的20～30倍,其中更換新液1～2次。(5)骨組織一般應先固定后脫鈣,或脫鈣、固定同時進行,未經骨定的骨組織不宜脫鈣,同時脫鈣液也不宜加溫。(6)注意脫鈣“終點”的鑒定,脫鈣“終點”的鑒定主要有物理檢測、X線照相技術和化學檢測法。

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