益生菌抗熱保護劑的研究

范娜，陳雪峰

（陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西 西安 710021）

益生菌抗熱保護劑的研究

范娜，陳雪峰*

（陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西 西安 710021）

益生菌抗熱保護劑的研究一直是工業化大規模生產益生菌產品的熱點與難點。本文選取海藻糖、明膠和甘油作為抗熱保護劑，研究其對嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌體的抗熱保護效果。結果表明，海藻糖、明膠和甘油均能夠提高菌體的抗熱存活率，可以作為抗熱保護劑。3種保護劑之間存在交互作用，復合使用時的抗熱保護效果比單獨使用時好，其最佳復合配方為海藻糖16%、甘油6%、明膠0.14%，菌體存活率可達16.58%，活菌數為1.66×108cfu/mL。

嗜酸乳桿菌；雙歧桿菌；抗熱保護劑

近年來，隨著人們對功能性食品要求的日益上升，益生菌產品成為促進人們身體健康的重要產品之一，尤其是作為日常食品，它們占據著世界65%的功能性食品市場[1]。FAO/WHO將益生菌定義為“當攝入一定量時能對宿主健康有作用的微生物活體”。嗜酸乳 桿 菌 （Lactobacillus acidophilus） 和 雙 歧 桿 菌（Bifidobacterium）是宿主（人和動物）腸道中的重要微生物，其能順利通過胃腸環境而定植腸內，當達到一定數量時，能夠改善、調節宿主腸道內微生物菌群的平衡，增強機體的免疫力，降低膽固醇水平以及抑制腫瘤細胞的形成等[2]。

然而，食品中活性益生菌保護的技術仍是一個巨大的難題，尤其是利用噴霧干燥法大規模生產粉狀活性益生菌產品的菌體抗熱性保護技術研究還很少。研制高活性粉狀益生菌產品的關鍵在于保護劑的使用。海藻糖、甘油和明膠是冷凍干燥技術中常用的菌體活性保護劑，但其對于菌體的抗熱保護效果目前研究較少，僅有戴秀玉[3]等討論了海藻糖對于嗜熱鏈球菌的高溫耐受性；呂嘉櫪[4]等探討了甘油等在72℃保溫30 min的條件下對嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌抗濕熱保護的影響；成妮妮[5]研究了動物、植物和微生物細胞中的提取物對菌體抗熱性的影響。本文選取海藻糖、甘油和明膠這3種物質作為抗熱保護劑，探討其對嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌株的抗熱保護效果，從而為工業化生產粉狀活性菌體產品提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌種為陜西科技大學食品科學研究室保藏。

海藻糖、甘油、明膠均為食品級。使用1/15 mol/L、pH6.98的磷酸鹽緩沖溶液將明膠溶解配制成所需濃度的溶液，114℃、滅菌10 min，冷卻后4℃冰箱中保存備用。使用前在37℃水浴中預熱10 min[6]。海藻糖和甘油使用無菌水配制成所需濃度的溶液，無菌微孔濾膜過濾（現用現制）。配制的保護劑溶液確認無菌后方可使用。

MRS液體培養基[7]：用于菌體擴大培養。

MRS固體培養基：在液體培養基的基礎上加入1.5%的瓊脂即可，用于菌落計數。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-ID型淡然凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；GH4500型隔水式恒溫培養箱：天津泰斯特有限公司；PB-10酸度計：德國賽多利斯科學儀器有限公司；UV-754型紫外分光光度計：上海第三分析儀器廠；XS-402型顯微鏡：南京江南永新光學儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；H1850R型高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及擴大培養

將嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌種由固體斜面培養基接入液體培養基中，37℃恒溫培養24 h，反復活化2次～3次。將活化好的純菌種以4%的接種量接種于MRS液體培養基中，37℃恒溫箱中進行擴大培養。

1.3.2 菌體生長特性的測定及收集

菌體擴大培養時每隔2 h取樣進行活菌計數，同時測定培養液pH值和600 nm下吸光值（OD值），繪制菌體生長曲線，確定出菌體最佳收集時間。

擴大培養的菌液10℃下，6000 r/min離心15 min，棄上清液，用無菌生理鹽水沖洗沉淀，制成活菌數為1.0×109cfu/mL的菌懸液。

1.3.3 單一保護劑對菌體抗熱性的影響

海藻糖、甘油、明膠3種保護劑濃度水平如表1。菌懸液中加入保護劑后于75℃保溫30 min[5]，進行活菌計數并計算存活率。

表1 單因素試驗設計Table 1 Single factor experiment design

1.3.4 復合保護劑對菌體抗熱性的影響

由單因素實驗結果，利用SAS9.0軟件中的Box-Behnken試驗設計，設計復合保護劑配方因素水平表（表 2）。

表2 Box-Behnken設計試驗因素水平Table 2 Factor level of Box-Behnken design

1.3.5 活菌計數：平板計數法[8]。

活菌數（cfu/mL）=3個平行平均菌落數×稀釋倍數/接種量（mL）

存活率=（保溫后活菌數/保溫前活菌數）×100%

2 結果與分析

2.1 菌體生長特性的測定

菌種擴大培養過程中菌體在MRS液體培養基中的活菌數、OD值及pH值變化如圖1所示。

圖1 MRS培養基中菌體生長曲線Fig.1 Probiotics growth curve on MRS medium

從圖1可以看出，培養0～6 h，培養液pH值緩慢下降、OD值緩慢上升，活菌數由起始濃度5.62×104cfu/mL僅上升到1.41×105cfu/mL，菌體數量增加緩慢，這一時期菌體處于生長延滯期；在6 h～18 h，pH變化很大，OD值和菌體數均增長很快，菌體處于對數生長期；18 h后，pH值、OD值和活菌數都基本保持穩定，變化很小，表明此時菌體生長進入穩定期，同時產生大量的代謝產物，此時最大活菌數為1.05×108cfu/mL；24 h時，活菌數略有下降，菌體衰亡速率大于生長繁殖速率，開始進入衰亡期，這是由于培養液中可利用的營養物質缺乏，培養體系中pH較低抑制了菌體的生長。其生長周期符合一般細菌的生長規律。

根據MRS培養基中菌體生長曲線，可以確定4%接種量、37℃恒溫培養的菌體最佳收獲期應在18 h～20 h，即在剛剛進入穩定生長期時收集菌體，能夠獲得較多的活性菌體。

2.2 單一保護劑對菌體抗熱性的影響

加入不同保護劑75℃保溫30 min后，菌體存活率見表3。

表3 單一保護劑對菌體存活率的影響Table 3 The effects of single protective agent on the rate of the survival probiotics

由表3可看出，加入保護劑后經熱處理過的菌體均呈現出一定的存活率（不加保護劑，同樣條件下熱處理后菌體存活率為零），說明所選擇的3種保護劑都可以提高菌體的抗熱性。3種保護劑中，明膠的保護效果最好，菌體存活率最高可達12.72%；海藻糖次之，菌體存活率最高為11.87%；甘油最小，為11.47%。其中，使用明膠的菌體存活率隨其使用濃度的增大而逐漸提高，但使用濃度大于0.15%后，菌體存活率上升幅度很?。欢褂煤Ｔ逄呛透视偷木w存活率，都呈現出隨其用量的增加先上升后下降的趨勢。這表明保護劑的種類不同對菌體的抗熱保護效果也各不相同，這與呂嘉櫪等[4]在72℃保溫30 min的條件下得到的有關甘油等對嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌抗濕熱保護的研究結果類似；同一保護劑對菌體的抗熱保護效果隨其使用濃度的不同亦不同，3種保護劑各自適宜的使用濃度分別為：海藻糖15%、甘油6%、明膠0.15%。

2.3 復合保護劑對菌體抗熱性的影響

2.3.1 Box-Behnken實驗設計結果

以3種保護劑為3個自變量，菌體存活率為響應值，對嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌種的抗熱保護劑配方進行優化，Box-Behnken設計法進行實驗后所得結果如表4。

表4 Box-Behnken設計方案及結果Table 4 Program and results of Box-Behnken design

2.3.2 回歸方程的建立

對Box-Behnken試驗的結果（表4）進行方差分析和響應面二次回歸模型擬合，有關參數見表5。

表5 回歸模型方差分析Table 5 ANOVA for response surface quadratic model

由表5看出，選取95%的置信度，海藻糖、明膠以及它們的二次項及其3種保護劑之間的交互效應對菌體抗熱存活率的影響都顯著，而甘油對菌體的抗熱存活率影響不顯著。因此，各實驗因素與響應值之間存在非線性關系，擬合的二次模型為Y=－24.9993+2.4586X1+296.111X3－0.0542X1X1+0.0732X2X2－666.217X3X3－0.0098X1X2－5.4826X2X3－4.7200X1X3。在表 5中，相關系數（R-square）=99.12%，失擬項（Lack of fit）=0.367376為不顯著，說明所擬合的二次模型信任度高，能夠進行實驗預測。

2.3.3 響應面因子水平優化

用SAS對響應面模型進行典型性分析（canonical analysis）,可知響應值Y（菌體存活率）對因子X1（海藻糖）與X3（明膠）的改變更敏感，因子X2（甘油）不顯著，固定X2用量（甘油X2=6%），生成X1與X3對Y的響應面趨勢圖和等高線圖，如圖2。

圖2 海藻糖和明膠對菌體存活率影響的響應面分析圖（a）和等高線圖（b）Fig.2 Surface plot and contour plot of effects of trehalose and gelatin on the rate of the survival probiotics

由響應面趨勢圖可看出，當明膠使用濃度一定時，海藻糖對菌體存活率的影響隨其用量的增加逐步升高最終趨緩；而固定海藻糖用量時，明膠對菌體存活率的影響隨其濃度的增加呈先上升后下降的趨勢。這一點與單因素試驗結果不相一致。這可能是由于保護劑復配使用后，它們之間存在交互效應所致。等高線圖中，等高線呈現明顯的橢圓，亦說明海藻糖和明膠間的交互效應顯著。因此，對響應值進行嶺脊分析，得出Y取最大值（16.4776%）時的因子水平代碼值為（X1=0.17019，X2=0.00731，X3=-0.16162），再結合表 43 個因子對Y的顯著性影響，可選取嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌種抗熱保護劑的最佳配方為：海藻糖15.85%、甘油為6%、明膠0.14%。

通過驗證實驗，嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌體在使用復合保護劑（海藻糖16%（近似）、甘油6%、明膠0.14%）后，75℃保溫30 min處理，菌體存活率可達16.58%，與數學模型預測的菌體存活率基本相符，說明響應面法得到的數學模型與實驗數據擬合較好。

3 結論與討論

本試驗所選擇的3種物質均能一定程度的提高菌體抗熱性，這與它們各自的特性密切相關。海藻糖能夠滲透到細胞內部并填充在蛋白質等活性大分子周圍，當細胞外溫度較高時，細胞會失水而海藻糖的羥基可與生物分子的極性基團形成氫鍵，代替極性基團周圍失去的水分子，從而維持蛋白質分子的穩定性[9-10]。甘油屬低分子中性物質，在溶液中易結合水分子，發生水合作用，使溶液的黏性增加，從而減輕了細胞外溶質濃度升高所造成的細胞損傷。同時，甘油進入細胞后，使細胞內溶質度升高，細胞內壓力接近于細胞外壓力，減少了細胞受熱時脫水的程度和速度[5]。明膠是一種變性蛋白質，具有凝集作用[11]，在熱水中會形成熱可逆性凝膠，它具有優良的持水性，可阻止細胞變形從而提高菌體的抗熱性。

根據SAS9.0軟件響應面分析方法，優化后的復合保護劑配方為：海藻糖16%、甘油6%、明膠0.14%，在75℃保溫30 min的處理下，菌體存活率可達到16.58%，活菌數為1.66×108cfu/mL。較成妮妮[5]報道的相關嗜酸乳桿菌的復配抗熱保護劑配方中菌體最大存活率（僅0.2329%）有很大提高。本研究所得的保護劑配方雖能夠提高嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌體的抗熱性，但能否用于噴霧干燥過程中的抗熱保護還有待進一步研究。

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Study of Thermal Resistant Protective Agents of Probiotics

FAN Na,CHEN Xue-feng*
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，Shaanxi，China）

The study about the thermal resistant protective agents of probiotics was the hot and difficult subject in the manufacturering of the probitic products on large industrial scale.Trehalose,gelatin and glycerin were used as thermal resistant protective agents to evaluate their thermal resistant protective effects on probiotics mixture of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium.The results indicated that trehalose,gelatin and glycerin,which were able to improve the thermal resistant survival rate of probiotics,can be used as thermal resistant protective agents.The protective effects of composite agents were better than the single one due to the interactive effects of the three agents.The optimal composition of protective agents were trehalose 16%,glycerin 6%and gelatin 0.14%,then the rate of the survival probiotics reached 16.58%,the viable cell numbers was 1.66×108cfu/mL.

bifidobacterium；Lactobacillus acidophilus；thermal resistant protective agent

陜西科技大學博士科研啟動基金項目（BJ09-22）

范娜（1986—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

*通信作者：陳雪峰（1964—），教授，博士生導師，研究方向：食品加工。

2010-09-21