苦蕎麥多糖的抗氧化作用

譚萍，方玉梅，王毅紅，張春生

（貴州六盤水師范學院，貴州 六盤水 553004）

苦蕎麥多糖的抗氧化作用

譚萍，方玉梅，王毅紅，張春生

（貴州六盤水師范學院，貴州 六盤水 553004）

為進一步開發利用苦蕎資源，研究苦蕎麥多糖的抗氧化性。通過鄰苯三酚自氧化法、水楊酸法比色法分別測定苦蕎麥多糖清除超氧陰離子自由基（O2-·）以及羥基自由基（·OH）的效果。結果表明不同濃度的苦蕎多糖能顯著地清除超氧陰離子自由基和羥基自由基，隨著苦蕎麥多糖濃度的升高其抗氧化性作用逐漸增強。

苦蕎麥；多糖；抗氧化；自由基

近年來大量醫學研究說明，人體的多種疾病和過早衰老，是由于體內過多的氧自由基（游離基）將正常細胞氧化破壞造成?？寡趸瘎┠軌蛳@些氧自由基，阻緩氧化反應，因而有良好的保健、防衰老和減少疾病的作用。盡管長生不老只是個夢想，但是減少疾病、延緩衰老是所有人的愿望。因此，對清除自由基的天然抗氧化劑研究，已受到普遍關注?？寡趸瘎V泛應用于食品、藥品、保健品等行業，需求量逐年增加，其中天然抗氧化劑的應用越來越廣泛。許多學者已經從多種植物中提取了天然抗氧化劑，并證明許多植物中含有抗氧化效果很好的活性物質[1-2]。

植物多糖具有增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血等多種生物學功效,而且對機體幾乎沒有毒性,故對植物多糖生物學功效的研究愈來愈引起國內外藥理學家、生物學家和化學家們的興趣,它已成為當代生物學的熱門領域。

農業、醫學及食品營養學等方面的研究結果顯示，苦蕎麥其營養價值居所有糧食作物之首，因而蕎麥研究備受各國重視。目前，大多數對蕎麥的研究均集中于次生代謝物質（生物類黃酮）的含量上，對蕎麥多糖的研究鮮見報道。但是苦蕎麥中次生代謝物質的含量畢竟較少，而多糖是初生物代謝產物，其含量較生物類黃酮要大得多，本文采用鄰苯三酚自氧化法、水楊酸法比色法對苦蕎麥多糖的超氧陰離子自由基（O2-·）以及羥基自由基（·OH）的清除能力進行了初步探討，以期為苦蕎麥的進一步研發和應用提供相應的依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

六苦2號（由貴州六盤水市農科所提供）；無水葡萄糖、碳酸氫鈉、濃硫酸、苯酚、乙醇、鋁片、鄰苯三酚、FeSO4·7H2O、水楊酸、鹽酸、過氧化氫、無水乙醇、Tris、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醚等試劑均為市售國產分析純。

1.2 儀器

UV-9100紫外分光光度計：北京瑞利公司；sartoriusBS110S電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋、FW80型高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 苦蕎麥多糖樣品的制備[3-4]

1.3.1 苦蕎麥多糖的提取方法

苦蕎麥多糖的提取：準確稱取新鮮六苦2號蕎麥種子（65℃烘干至恒重）1 g，于燒瓶中加入100 mL蒸餾水，70℃水浴回流提取1 h，過濾，并用蒸餾水再重復提取1次，合并2次濾液并容至200 mL，得到苦蕎麥多糖提取液。

1.3.2 苦蕎麥多糖樣品濃度測定

繪制標準曲線：稱取在105℃干燥至恒重的無水葡萄糖0.100 g，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精確吸取上述溶液1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。精確吸取上述溶液3.0 mL，置10 mL容量瓶中，加入5%苯酚1 mL，混勻，再加入濃硫酸7 mL并計時，加水至刻度，旋渦混合5 min，放置1 min，加水至刻度，混勻，室溫20 min，再加水至刻度，備用。精確量取0.500 mg/mL葡萄糖溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL，分別置 50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配成不同濃度的對照品系列溶液。于485 nm波長處測定吸光度A。

根據標準曲線的制作方法，以濃度（C，μg/mL）為橫坐標，吸光值（A，510 nm）為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸方程：

苦蕎麥多糖樣品含量的測定步驟：吸取50 μL樣品于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，精確吸取3 mL，置10 mL容量瓶中，加入5%苯酚1 mL，混勻，再加入濃硫酸7 mL并計時，旋渦混合5 min，放置1 min，混勻，室溫20 min，再加水至刻度。于485 nm波長處測定吸光度A。

1.4 苦蕎麥多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）的抑制率[4]

1.4.1 鄰苯三酚自氧化速率的測定

取 5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH8.2），2 mL雙蒸水混勻后在25℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25℃預熱過的3 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL（以10 mmol/L HCl配制，空白管用10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚HCl溶液），迅速搖勻后倒入比色杯，420 nm下每隔30 s測定吸光度值。

1.4.2 樣品活性測定

按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先分別加入0.2 mL不同濃度的樣品液，蒸餾水減少。同樣以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照。測定吸光度，并計算抑制率。

多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）抑制率/%＝（A0-A1）/A0×100

式中：A0為鄰苯三酚自氧化平均吸光度；A1為加入樣品液后鄰苯三酚自氧化平均吸光度。

1.5 苦蕎麥多糖對·OH的抑制率[5]

按照Smirnof（1989）的方法，利用H2O2與FeSO4混合產生·OH，在體系內加入水楊酸捕捉·OH并產生有色物質，該物質在510 nm下有最大吸收。

反應體系：于25 mL容量瓶中依次加入2 mmol/L FeSO45 mL，6 mmol/L H2O25 mL，6 mmol/L水楊酸-乙醇15 mL，于37℃水浴中保溫15 min取出，以超純水為參比，510 nm下測其吸光度（A0），然后加入1 mL被測定樣品，搖勻，水浴37℃水浴中保溫15 min后取出，以超純水為參比，510 nm下測其吸光度（Ax）。

考慮到色素本身的吸收光值，做對照實驗：于25mL容量瓶中依次加入2 mmol/L FeSO45 mL，雙蒸水5 mL，6 mmol/L水楊酸-乙醇15 mL，于37℃水浴中保溫15 min，然后加入1 mL被測定樣品，搖勻，水浴37℃水浴中保溫15 min后取出，以超純水為參比，510 nm下測其吸光度（Ax0）。

按下式計算抑制率：

多糖對·OH 的抑制率/%＝[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100式中：A0為用蒸餾水代替樣品的對照值；Ax為加樣后的吸光度；Ax0為樣品本身的本底值。

2 結果與分析

2.1 苦蕎麥多糖樣品濃度測定結果

根據實驗所得標準曲線回歸方程為Y=0.007097X-0.05023[式中：Y 為吸光度；x 為濃度，（μg/mL）]，計算樣品液濃度，結果如下：

在485 nm下測得苦蕎麥多糖提取液的吸光度Y=0.104，根據上述公式計算得到：X=21.7641 μg/mL。

2.2 苦蕎麥多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）抑制作用的效果

分別取苦蕎麥多糖提取液 0.006、0.008、0.010、0.015、0.020 mL放入10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，作為不同濃度的苦蕎麥多糖的樣品液，分別標示為樣品1～樣品5。

每隔30 s所測鄰苯三酚自氧化的吸光度結果如表1。

表1 每隔30 s所測鄰苯三酚自氧化的吸光度Table 1 Absorbance of pyrogallol autoxidation at a distance from every 30 s

由表1得鄰苯三酚自氧化平均吸光度A0=0.064。

每隔30 s所測加入苦蕎麥多糖后鄰苯三酚自氧化的吸光度結果如表2。

表2 每隔30 s所測加入苦蕎麥多糖后鄰苯三酚自氧化的吸光度Table 2 Absorbance of pyrogallol autoxidation adding the polysaccharide in Tartary Buckwheat at a distance from every 30 s

苦蕎麥多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）的抑制率：抑制率/%＝（A0-A1）/A0×100。

計算苦蕎麥多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）的抑制率，所得結果見表3。

表3 苦蕎麥多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）的抑制率Table 3 Inhibition of super oxygen in clearance in the polysaccharide compound in Tartary Buckwheat anion free radical（O2-·）

表3結果表明：苦蕎多糖對超氧陰離子有明顯的抑制作用，在樣品濃度為 0.013 μg/mL～0.044 μg/mL 的范圍內隨加入多糖濃度越高，抑制作用越明顯。且當多糖濃度為0.044μg/mL時，抑制率達到最高為82.81%。

2.3 苦蕎麥多糖對·OH抑制作用的效果

分別取苦蕎麥多糖提取液 5、6、7、8、9 mL 放入10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，作為不同濃度的苦蕎麥多糖的樣品液，分別標示為樣品1～樣品5。

根據公式，抑制率/%＝[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100 計算抑制率，其結果如表4。

從表4結果表明：苦蕎麥多糖對羥基自由基也有抑制作用，且抑制率在10.882 μg/mL至19.588 μg/mL的濃度范圍內，是隨著多糖濃度的增大而增大的。當多糖濃度為19.588 μg/mL時，抑制率達到最大為17.50%。

表4 苦蕎麥多糖對·OH抑制率Table 4 Inhibition in clearance in the polysaccharide compound in Tartary Buckwheat of the hydroxyl radical（·OH）

3 結論與討論

苦蕎麥作為一種傳統作物，其營養價值居所有糧食作物之首,不僅營養成分豐富，營養價值高，而且含有大量的多糖化合物。近代，隨著人們的生活水平的提高，人類對保健越來越重視，而多糖由于其獨特的保健功能而備受人們的關注。

多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子機構復雜且龐大的糖類物質。通常具有貯藏生物能和支持結構的作用。多糖類化合物廣泛存在于動物細胞膜和植物、微生物的細胞壁中，是由醛基和酮基通過苷鍵連接的高分子聚合物，也是構成生命的四大基本物質之一。20世紀50年代發現真菌多糖具有抗癌作用，后來又發現地衣、花粉及許多植物均含有多糖類化合物，并進行分離提純，確定了其化學結構、物理化學性質、藥理作用，尤其對多糖類化合物的抗腫瘤和免疫增強作用進行深入研究。

基于這兩大背景，對苦蕎麥多糖的抗氧化性進行了研究。研究結果表明：苦蕎麥多糖對清除超氧陰離子自由基O2-和抑制·OH都有明顯的效果。尤其其多糖對清除超氧陰離子自由基的作用效果明顯高于對·OH的清除效果。

由本實驗可以得到初步結論：苦蕎麥多糖具有抗氧化性，可成為衰老保健品輔料或功能因子。但其成分多樣，結構復雜，進一步的純化和構效關系研究需進行。

[1]許申鴻，杭瑚.20種植物水對DPPH·的清除作用[J].中國野生植物源，1999，18(3):50-51

[2]許宗運，馬少賓，張秀萍，等.DPPH·法評價37種植物抗氧化活性[J].塔里木農墾大學學報，2004(2):1-4

[3]毛莉娟，劉學文，冉旭.苦丁茶中黃酮的提取工藝[J].食品科技，2002(11)：18-21

[4]張萍，王玉珠，李紅寧，等.蕎麥多糖的提取方法及含量測定[J].湖北農業科學，2008(8)：954-956

[5]譚萍，方玉梅，王毅紅，等.苦蕎種子黃酮類化合物的抗氧化作用[J].貴州農業科學，2009(3)：30-32

[6]汪河濱，白紅進，王金磊，等.黑果枸杞色素清除自由基活性的研究[J].食品研究與開發，2006，27(11)：8-10

[7]汪海波，劉大川，佘珠化，等.大豆異多糖類物質的提取、抗氧化性及穩定性研究[J].食品科學，2004，25(1)：111-114

[8]藍航蓮，孫樹霞.柑橘類多糖的生理活性研究進展[J].中國食物與營養，2003(2)：44-66

The Anti-Oxidation of Polysaccharide in Tartary Buckwheat

TAN Ping,FANG Yu-mei，WANG Yi-hong，ZHANG Chun-sheng
（Liu Panshui Normal College，Liupanshui 553004，Guizhou，China）

Aiming at the further exploration of the polysaccharide in Tartary Buckwheat resource,a study the antioxidant action of polysaccharide in Tartary Buckwheat is made.This text passes pyrogallol autoxidation method，the salicylic acid method colorimetry distinguishes to measure the super oxygen in clearance in polysaccharide compound in Tartary Buckwheat anion free radical（O2-·），the result of the hydroxyl radical（·OH）.The result expresses the polysaccharide in Tartary Buckwheat compound of the different density can show the super oxygen in a clearance anion free radicals with the free radicals of hydroxyl radical（·OH）.Go up along with the polysaccharide in Tartary Buckwheat compound density,its function of anti-oxidation will be strengthen gradually.

Tartary Buckwheat；polysaccharide；anti-oxidation；free radical

六盤水師范學院科研基金資助項目（2010-05）

譚萍（1963—），女（漢）,教授，本科，主要從事植物生理學與分子生物學的教學與研究。

2010-09-20