低溫提取南瓜多糖的理化性質(zhì)及清除DPPH自由基作用

于斐，李全宏

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

低溫提取南瓜多糖的理化性質(zhì)及清除DPPH自由基作用

于斐，李全宏*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

首次采用低溫水提的方法對(duì)南瓜多糖進(jìn)行提取，從得率、理化性質(zhì)、清除DPPH自由基活性方面對(duì)低溫提取的南瓜多糖進(jìn)行了研究，并與高溫提取的南瓜多糖進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)緩凍處理后，室溫提取的南瓜多糖得率為5.06%，低于70℃提取的多糖得率5.48%（P>0.05）。低溫提取的南瓜多糖為白色粉末，I2-KI反應(yīng)陰性，分子量分布主要為4 ku～270 ku；低溫南瓜多糖清除DPPH自由基的效果明顯高于高溫提取的南瓜多糖（P<0.05）。

南瓜；多糖；低溫；性質(zhì)；DPPH自由基

活性多糖是多糖中具有生物生理活性和特殊保健功能的一類物質(zhì)。20世紀(jì)50年代，日本科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)香菇中存在能抗輻射和抑制腫瘤生長(zhǎng)甚至使腫瘤縮小的物質(zhì)，后證實(shí)這種物質(zhì)是香菇多糖[1]。隨后，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家掀起了一股研究開發(fā)活性多糖的熱潮 ，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道活性多糖的藥理功能有：增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗突變、抗輻射、抗病毒、降血糖、降血脂等[2]。目前南瓜多糖多采用熱水浸提的方法獲得，張擁軍等采用60℃～100℃熱水提取[3]，孔慶勝等采用了甲醇回流，煮沸6 h來提取[4]。根據(jù)研究報(bào)道，很多天然物質(zhì)在高溫時(shí)，易受到破壞，使其生物活性降低或喪失。但是多糖的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)不會(huì)受到高溫的影響，低溫提取的南瓜多糖（LTPP）與高溫提取的南瓜多糖（HTPP）有什么差異，目前尚鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本課題就低溫提取的南瓜多糖的性質(zhì)進(jìn)行了研究，并將其與高溫提取的南瓜多糖的性質(zhì)進(jìn)行了比較。這一研究為活性多糖的研究提供了新的方向，也為今后的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，緩凍能明顯提高南瓜多糖提取得率，尤其是緩凍的效果更為明顯，為了準(zhǔn)確、高效的提取分離到南瓜多糖的功能性成分，在實(shí)驗(yàn)中采用緩凍強(qiáng)化，低溫提取的方法提取南瓜粗多糖。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜：購(gòu)于市場(chǎng)；DPPH、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司；透析袋MW3500：美國(guó)；其他試劑均為分析純：購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

TGL-16A臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；2802紫外可見分光光度計(jì)：尤尼科（上海儀器有限公司；液相：德國(guó)KNUAER公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 南瓜多糖的提取[7]

準(zhǔn)確稱取緩凍后的南瓜100 g，切塊，打磨成漿，以料液比 1:4（g:mL）加入去離子水，浸提一定時(shí)間，4 層絹布過濾，收集濾液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/2。濃縮液即為南瓜多糖提取液。

1.2.2 脫蛋白

采用 Sevag 法進(jìn)行。按多糖:氯仿:正丁醇=15:4:1的比例（體積比）振蕩混，4000 r/min離心分離，反復(fù)進(jìn)行多次，直至無白色沉淀為止。

1.2.3 醇沉

將無水乙醇緩慢加入到濃縮后的多糖溶液中，乙醇終濃度為75%，于4℃冰箱中醇沉12 h，4200 r/min離心20 min，收集沉淀，即得南瓜多糖。

1.2.4 透析

將樣品溶液裝入透析袋中，于去離子水中透析72h，以去除離子、小分子物質(zhì)和多肽。

1.2.5 冷凍干燥

將透析液液進(jìn)行凍干,最后得白色粉狀南瓜多糖粗品。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 多糖含量測(cè)定[8-9]

采用硫酸-苯酚法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定[8-9]

采用Folin-酚法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 還原糖含量測(cè)定[10]

DNS法。

1.3.4 平均聚合度測(cè)定[11]

平均聚合度=總糖含量/還原糖含量。

1.4 理化性質(zhì)分析

1.4.1 Molish反應(yīng)[12]

取1 mL南瓜多糖溶液（1 mg/mL）置于試管中,加入2滴5%α-萘酚-乙醇溶液,揺勻,將試管傾斜,沿試管壁緩緩加入1 mL濃硫酸，豎直試管，觀察濃硫酸和糖交界面顏色的變化。以純水作陰性對(duì)照,淀粉溶液（1 mg/mL）作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4.2 硫酸-蒽酮反應(yīng)[12]

取1 mL南瓜多糖溶液（1 mg/mL）置于試管中，加入新配制的蒽酮試劑。搖勻，于沸水浴中加熱10 min，取出冷至室溫，觀察顏色變化。對(duì)照同1.4.1。

1.4.3 碘-碘化鉀反應(yīng)[13]

取1 mL南瓜多糖溶液（1 mg/mL）置于試管中，加入I2-KI溶液，觀察顏色變化。對(duì)照同1.4.1。

1.4.4 分子量測(cè)定

色譜條件：Shodex SB-805 HQ，流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3，流速 0.5 mL/min，柱溫 35 ℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取適量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品T5、T12、T25、T50、T270、T670溶于純水。可得分子量與出峰時(shí)間的關(guān)系。

樣品測(cè)定方法同上。

1.5 DPPH自由基清除作用的測(cè)定[14]

取一定濃度的糖溶液1.5 mL，加入0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液3 mL，混勻后，25℃靜置20 min后在517 nm處測(cè)吸光度值。以蒸餾水代替樣品作為空白，以酒精溶液代替DPPH-乙醇溶液作為對(duì)照。

DPPH 自由基清除率=[1-（Asample-Acontrol)/Ablank]×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 南瓜多糖得率

不同提取條件對(duì)南瓜多糖得率的影響見圖1。

圖1 不同提取條件下南瓜多糖的得率Fig.1 The yield of pumpkin polysaccharides at different conditions

由圖1可知，緩凍后南瓜多糖的得率明顯高于未緩凍的樣品，這是由于緩凍過程中破壞了南瓜的細(xì)胞壁，更有利于多糖的溶出。高溫也可以使南瓜細(xì)胞“崩解”促進(jìn)多糖的溶出。緩凍和高溫都可以起到破壁的作用，因此HTPP的得率雖然高于LTPP的得率，但是并沒有顯著的差別，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，高溫提取的南瓜多糖的得率反而降低，可能是高溫條件破壞了某些糖類的結(jié)構(gòu)。因此，LTPP選擇25℃，提取6 h；HTPP選擇70℃提取4 h。

2.2 南瓜多糖的理化性質(zhì)

南瓜多糖的理化性質(zhì)見表1。

表1 南瓜多糖的理化性質(zhì)Table 1 The Physicochemical properties of polysaccharide

南瓜多糖為白色粉末，溶于水，由表1可知，Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，硫酸-蒽酮反應(yīng)呈陽(yáng)性，說明提取物為多糖，I2-KI反應(yīng)呈陰性，說明為非淀粉性多糖。Sevag法可以脫除游離蛋白，經(jīng)脫蛋白后LTPP的蛋白含量明顯高于HTPP，這可能是由于LTPP含有較多的南瓜糖蛋白復(fù)合物，從而使兩者的功能性質(zhì)產(chǎn)生差異。根據(jù)平均聚合度和分子量分布圖，可知LTPP的分子量要低于HTPP，尤其是高分子量組分比較低。這也解釋了LTPP溶解度較高的原因。

多糖標(biāo)品的分布如圖2所示，根據(jù)圖2計(jì)算得多糖分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)曲線：logM=-0.5501x+14794 R2=0.9878。根據(jù)樣品的出峰時(shí)間，即可計(jì)算出樣品的分子量分布范圍，LTPP和HTPP的分子量見圖3，計(jì)算可得，LTPP的分子量范圍為：4 ku～270 ku；HTPP的分子量范圍為：4 ku～270 ku。

圖2 多糖標(biāo)品的分子量分布圖Fig.2 The molecular weight distribution of polysaccharide standard

2.3 清除DPPH自由基的作用

DPPH自由基是一種比較穩(wěn)定的自由基，與其他自由基評(píng)價(jià)抗氧化的方法相比，DPPH自由基方法能夠快速的反應(yīng)樣品的抗氧化活性。南瓜多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖4。

圖3 南瓜多糖的分子量分布圖Fig.3 The molecular weight distribution of pumpkin polysaccharide

圖4 南瓜多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.4 The DPPH radical scavenging activity of punpkin polysaccharide

由圖4可知，南瓜多糖對(duì)DPPH自由基有明顯地清除作用，清除率和多糖的含量存在著一定的量效關(guān)系。這可能與南瓜多糖分子中的還原性的半縮醛羥基有關(guān)。南瓜多糖在2 mg/mL～5 mg/mL的范圍能夠有效的清除DPPH自由基，達(dá)到50%清除率需要LTPP的量為3.6 mg/mL。LTPP對(duì)DPPH自由基的清除作用要好于HTPP，尤其是在濃度增大時(shí)。其它抗氧化活性實(shí)驗(yàn)以及其抗氧化機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文對(duì)低溫提取南瓜多糖的性質(zhì)進(jìn)行了研究，LTPP為白色粉末，主要為分子量分布范圍為4 ku～270 ku的非淀粉多糖。緩凍處理可以有效提高南瓜多糖得率，而且低溫提取可以節(jié)約大量能源，降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)環(huán)保生產(chǎn)。對(duì)南瓜多糖抗氧化的初步研究表明南瓜多糖具有良好的DPPH自由基清除作用，但對(duì)南瓜多糖的其他功能活性，尤其是高純度的LTPP的藥理作用，目前尚需進(jìn)一步研究，為開發(fā)保健品和高附加值的工業(yè)化南瓜產(chǎn)品，提供理論依據(jù)。

[1]H-D Bellitz,W Grosch,P Schieberle.食品化學(xué)[M].3 版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社：92-112

[2]李延華.果蔬中多糖功能因子的研究概況及開發(fā)利用[J].北方園藝,2008(12):75-77

[3]張擁軍,姚惠源.南瓜多糖的分離、純化及其降血糖作用[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2002,17(4):59-62

[4]孔慶勝，蔣瀅.南瓜多糖的分離純化及其降支鏈氨基酸作用[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,35(1):29-31

[5]向東.南瓜多糖的提取及研究[D].廣東：華南理工大學(xué),2004：11-12

[6]付才力.南瓜糖肽和木葡聚糖的分離純化及其功能研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2006：13-14

[7]孔倩,周婷,武改蘭，等.南瓜水溶性多糖的制備及硫酸酯化初步研究[J].食品科學(xué)，2009,30(16):73-77

[8]韓雅珊.食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1996：34-37

[9]張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].浙江:浙江大學(xué)出版社,1999:10-12

[10]WichienchotS，JatupornpipatM，RastallRA，etal.Oligosaccharides of pitaya(dragon fruit)flesh and their prebiotic properties[J].Food chemistry，2010，120(3)：850-857

[11]I Defloor,V Vandenreyken,P J Grobet，et al.Fractionation of maltodextrins by ethanol[J].Journal of Chromatography A，1998(803):103-109

[12]李軍,蔣碧蓉,王海妹，等.海星多糖的分離純化及鑒定[J].食品工業(yè)科技，2010(2):121-124

[13]孟慶勇,劉志輝,徐美奕，等.半葉馬尾藻多糖的提取和分析[J].光譜學(xué)與光譜分析，2004,24(12):1560-1562

[14]Bao Yang,Mouming Zhao,K Nagendra Prasad,et al.Effect of methylation on the structure and radical scavenging activity of polysaccharides from longan(Dimocarpus longan Lour.)fruit pericarp[J].Food Chemistry,2010(118):364-368

The Physicochemical Properties and Radical Scavenging Activity of Pumpkin Polysaccharides Extracted at Low Temperature

YU Fei,LI Quan-hong*
（College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China）

Crude water-soluble pumpkin polysaccharides were extracted from pumpkin pulp at room temperature（25 ℃）.The yield,physicochemical properties and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides were studied and compared with which obtained at 70℃.The results indicated that after slow freezing treatment,the yield of polysaccharides extracted at 25℃ was 5.06%and that extracted at 70℃ was 5.48%.Their difference was not obviously.The pumpkin polysaccharides obtained at 25℃were white in colour,non-strach,and molecular weight ranged from 4 ku to 270 ku.Moreover the DPPH radical scavenging activity was higher than the polysaccharide obtained at 70℃.

pumpkin；polysaccharide；low temperature；propery；DPPH radical

自然基金（3067146）

于斐（1986—），女（漢），碩士研究生，研究方向：果蔬加工。

*通信作者：李全宏（1966—），男，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用。

book=202,ebook=202

2010-08-31