5種水溶性維生素在奶粉中的穩定性研究

劉志楠，喻東威，趙源，劉曉川，李梅，趙雅麗

（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司質量管理系統分析檢測中心，內蒙古 呼和浩特 011500）

5種水溶性維生素在奶粉中的穩定性研究

劉志楠，喻東威，趙源，劉曉川，李梅，趙雅麗

（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司質量管理系統分析檢測中心，內蒙古 呼和浩特 011500）

微生物法檢測奶粉中水溶性維生素，為美國公職分析化學家協會AOAC要求的官方檢測方法，也為國標所采納，一直沿用至今。其靈敏度高，已被全世界所公認。但該法操作復雜，影響結果的因素很多，對檢驗人員和實驗室的要求較高。針對這一問題采取對同一樣品進行大量的實驗，以確定其波動性，為乳制品的檢測提供有力的數據支持。選取同一包奶粉進行多次重復測定，觀察其樣品與平均值的分布情況，相對標準偏差以及CV值。煙酸、泛酸、葉酸、VB12穩定性較好，生物素相對次之；煙酸和泛酸重復測定的精密度最好，葉酸和VB12相對較好，生物素精密度次之。

微生物法；煙酸；泛酸；葉酸；VB12；生物素；CV 值

維生素是維持生物正常生命過程所必需的一類小分子有機物，需要量很少，但對維持健康十分重要。維生素不能供給機體熱能，也不能作為構成機體組織的相應物質，其主要功能是通過作為輔酶的成分調節機體代謝。大多數的維生素體內一般不能合成或合成量不能滿足生理需要，必須從食物中攝取。長期缺乏任何一種維生素都會導致相應的疾病。

水溶性維生素也叫B族維生素，包括煙酸、泛酸、葉酸、VB12、生物素等12種水溶性維生素。多數維生素的性質不穩定，對光、氧、熱、pH等非常敏感，食物在加工、儲存、運輸、銷售等一系列環節都可能造成維生素的損失。為了彌補這種損失，維生素常常作為強化劑在食品工業的某些產品中使用。將合成的B族維生素添加到食品中補償人體生長和健康的需要已經成為一種世界范圍內的行動。

維生素是在食品中添加的微量生物活性成分，必須通過檢測來嚴格控制其在食品中的添加量。由于維生素通常是預混在食品中，所以具體的檢測工作常常在添加到食品之前進行；當然對于儲存一段時間后的食品，還應在之后重新檢測。

此外，為了評價食品標簽上標注成分的準確性。美國食品和藥物管理局FDA規定維生素在食品中的實際添加量必須為標簽上標注量的100%或更多,而原生維生素產品中的維生素含量必須為標簽上標注量的80%或更多（合理的超出部分通常認為是廠家在正常生產過程中產的）,European Directive2002/46/EC也制定了一系列法規,用于檢測添加過維生素的食品中標注的維生素含量[1]。

2010年我國針對食品安全體系存在的一些列問題作出了相應的規定，出臺了最新國家標準作為檢測乳品中各種營養素的國家強制性檢測標準，國標GB5413-2010[2-6]《乳產品標準及標準檢驗方法》對嬰幼兒配方食品與奶粉中維生素含量的檢測方法、檢測限度、適用范圍等都做了明確的規定。

目前我國維生素檢測相關標準涉及的方法有微生物法和高效液相色譜法。其中微生物法為水溶性維生素通用方法，為煙酸、泛酸、葉酸、VB12、生物素所共用，高效液相色譜法僅應用于煙酸和泛酸。

1 材料與方法

1.1 材料

奶粉。

1.2 試劑及設備

VB12、煙酸、葉酸、泛酸、生物素檢測培養基及標準品：購于中科院微生物研究所；無菌雙蒸水，酶標儀（630 nm）。超凈臺；微量移液器（100 μL～1000 μL、20 μL～200 μL）；一次性無菌濾膜（0.22 μm）；一次性無菌注射器。

1.3 菌種

德式乳桿菌Lactobacillusdelbrueckii.（ATCC7830）；植物乳酸桿菌Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）；鼠李糖乳桿菌 Lactobacillus rhamnosus（ATCC 7469）。

1.4 方法

微生物培養法：某些菌體生長對某種特定維生素具有較強的依賴性。配制選擇性的培養基，即含有菌體生長除待測維生素以外的所有營養元素。待測維生素添加的多少直接影響菌體的生長情況。通過添加不同濃度的待檢測維生素作為標注曲線，就可以半定量判定樣品中的特定維生素的含量，最后通過細菌生長的濁度顯示出來。

1.5 前處理

取1 g樣品至50 mL離心管中，準確加入雙蒸水39 mL，漩渦混勻。在超凈臺中用0.22 μm無菌濾膜過濾至1.5 mL或2.0 mL無菌試管中。

1.6 培養基制備

加入10 mL無菌水至維生素培養基中，蓋好瓶蓋，搖勻。在90℃～100℃水浴中加熱至少5 min，其間振蕩至少2次（保證瓶子封閉），迅速冷卻至室溫（低于30℃）。使用0.22 μm無菌濾膜過濾培養基至15 mL無菌離心管中。

1.7 標準品配制

VB12、煙酸、葉酸、泛酸、生物素標準品用無菌水配置成不同的濃度梯度，以無菌雙蒸水為參比，在630 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，標品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.8 檢測步驟

取出需要數量的微孔板條并在板上固定，未使用的微孔板條立即放回原來的箔袋中，并與干燥劑一起重新封好，儲存在2℃～8℃條件下；用移液器吸取150μL待檢維生素培養基至微孔中；用移液器吸取150 μL標準品或樣品至指定的微孔中；用粘合箔蓋住微孔條或微孔；除去粘合箔上的保護層，將其平放在微孔條上，用手或壓舌板將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條，保證粘合箔和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分；在（37±1）℃黑暗條件下（可用孵育器）孵育20 h～48 h。

1.9 測量及計算

用酶標儀630 nm條件下讀取混濁度。使用維生素專用軟件進行計算（4P法）。

2 結果

2.1 不同項目樣品檢測數值統計情況

對泛酸、煙酸、VB12、葉酸、生物素等5種維生素的平均值、標準偏差、RSD和CV值的統計結果見表1。

表1 同一奶粉檢測不同項目統計數值Table 1 The statistic value of different item for the same milk power sample

表1結果顯示：煙酸和VB12的CV值均為5%，精密度最高。泛酸和葉酸CV值均為7%，精密度緊隨其后。生物素的精密度相對較低，CV值為14%。

2.2 不同項目樣品檢測數值與平均值的偏離情況

對泛酸、煙酸、VB12、葉酸、生物素等5種維生素的平均值進行橫向的比較，橫線為各檢測項目的平均數值。結果見圖1～圖5。

如圖1～圖5所示：樣品結果成不規則分布，生物素結果分布的較為開闊，總體數值與平均值偏移較大。其余項目結果相對較好。

圖1 泛酸檢測同一樣品散點圖Fig.1 The same sample scatterplot of pantothenic acid determination

圖2 煙酸檢測同一樣品散點圖Fig.2 The same sample scatterplot of nicotinic acid determination

圖3 VB12檢測同一樣品散點圖Fig.3 The same sample scatterplot of vitamin 12 determination

圖4 葉酸檢測同一樣品散點圖Fig.4 The same sample scatterplot of folic acid determination

圖5 生物素檢測同一樣品散點圖Fig.5 The same sample scatterplot of biotin determination

3 結果與討論

實驗對同一樣品不同項目進行30個組份的測試，目的在于觀測微生物法檢測水溶性維生素的穩定性。結果顯示：煙酸、VB12、泛酸、葉酸的CV值均小于10%，符合國標所要求的在重復性條件下獲得的2次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

就樣品性質而言煙酸（煙酰胺）性質非常穩定，數據結果重復性很好，CV值為5%。其次VB12的CV值也達到了5%，精密度煙酸和VB12為最好。泛酸和葉酸CV值均為7%，精密度緊隨其后，但葉酸相對而言對光較為敏感，操作時要相對注意一些，以防止其見光分解。生物素相對于其他4種而言變化相對較大，CV值為14%。生物素的測定方法眾多，微生物法非常靈敏，但由于其他營養物質的影響，所以并非都能達到高準確性[7]。除生物素外，幾種維生素檢測結果與平均值偏離的范圍均比較小。方法重現性和人員的操作過程都在可以接受的范圍內。葉酸來源于綠葉蔬菜,缺乏時可引起細胞性貧血和粒細胞減少,尤其對于處于生長發育旺盛期的嬰幼兒,如果缺少足夠的葉酸,生長就會受到嚴重影響。孕婦在懷孕期間一般都需要補充葉酸，以防止胎兒畸形的產生。所以葉酸的檢測準確性尤為重要。

食品中維生素的測定方法是以儀器分析法為主，但對于少數幾種維生素由于其含量甚微，低于儀器的最低檢出限，目前仍然依靠微生物法進行測定。但微生物法不易掌握，因此將在測定中積累的一些經驗歸納總結，對食品企業或專業實驗室的維生素微生物法測定大有裨益。

[1]雷濤，張輝，韓惠雯，等.嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素的檢測方法研究[J].乳業科學與技術，2004(2):81

[2]中華人民共和國衛生部.GB 5413.15-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定[S].北京：中國標準出版社，2010：3-7

[3]中華人民共和國衛生部.GB 5413.17-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定[S].北京：中國標準出版社，2010：1-4

[4]中華人民共和國衛生部.GB 5413.14-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定北京：中國標準出版社，2010：1-4

[5]中華人民共和國衛生部.GB 5413.16-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定[S].北京：中國標準出版社，2010：1-6

[6]中華人民共和國衛生部.GB 5413.19-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定[S].北京：中國標準出版社，2010：1-4

[7]刁力蘭，李秀珍，楊平平，等.生物素測定方法的分析[J].食品與發酵工程，2007，33(6)：107

The Stable Study on Five Water-soluble Vitamin in Milk

LIU Zhi-nan,YU Dong-wei,ZHAO Yuan,LIU Xiao-chuan,LI Mei,ZHAO Ya-li
（Inner Mongolia mengniu dairy industry（group）limited company quality management department analysis test center Huhhot 011500,Inner Mongolia,China）

The microbiological method for assay of vitamin in milk power is the method of the AOAC official requirement,which is also adopted and continued up to now in Chinese national standard.It’s high sensitivity was generally accepted by the world,while the method raise relatively high demand for laboratory and analyst for its complicated operation and much influencing factors.For the question,we made lots of experiments to detect a sample to definite the fluctuation and provide suitable data.Repeated detected the same milk power sample and viewed the value distribution of the sample,the average,the relative standard deviation and the CV.Nicotinic acid,pantothenic acid,folic acid and Vitamin12 possess better stability than biotin;nicotinic acid and pantothenic acid were the best in precision,folic acid and vitamin12 were better than biotin.

microbiological method;nicotinic acid;pantothenic acid;folic acid;Vitamin12;biotin;CV value

劉志楠（1982—），男（蒙），分析研究員，碩士研究生，研究方向：食品檢測與分析。

2010-09-25