特發性血小板減少性紫瘢患者外周血淋巴細胞亞群和調節性T細胞的變化及臨床意義

佟海俠，馬良艷，陸春偉，王秋實

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院輸血科，沈陽110022；2.中國醫科大學公共衛生學院衛生檢驗教研室，沈陽110001）

特發性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是一種常見的出血性自身免疫病，但發病機制尚未完全明了，難以找到真正特異而有效的治療方法。近年來，越來越多的研究表明，ITP患者除有體液免疫異常外，都存在細胞免疫異常，發病與淋巴細胞亞群、細胞因子表達及功能改變有密切聯系［1］。同時研究發現調節性T細胞（T regulatory cell，Treg細胞）是維持機體免疫耐受的重要調控者，在自身免疫病中的作用逐漸成為研究的熱點。為了觀察淋巴細胞免疫功能在ITP發病機制中的可能作用及Treg細胞與ITP發生、發展的關系及其臨床意義，我們使用流式細胞分析儀檢測40例初診急性ITP患者外周血淋巴細胞亞群的水平和Treg細胞的數量，并與40例健康者進行比較，以觀察其在ITP發病中的變化和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象及分組：全部為中國醫科大學盛京醫院血液科門診及住院初診（治療前）急性ITP患者，診斷根據臨床血象和骨髓檢查確診，符合張之南《血液病診斷及療效標準》［2］，ITP組40例，男18例，女22例，年齡3～43歲，中位年齡18歲；健康對照組40例，男24例，女16例，年齡19～54歲，中位年齡35歲。

1.1.2 主要試劑和儀器：MultiSET四色免洗淋巴細胞亞群試劑盒、FACS Lysing Solution紅細胞裂解液、人調節性 T細胞檢測試劑盒（CD25-APC、CD4-FITC、Foxp3-PE）購自美國 BD 公司；FACSCalibur流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細胞亞群檢測方法：采集外周靜脈血2.0 mL，EDTA-K2抗凝后備用。取2支FACS專用試管，各加入50 μL充分混勻的抗凝全血，分別加入20 μL CD3/CD8/CD45/CD4 抗體和20 μL CD3/CD16+56/CD45/CD19標記的抗體。渦旋混勻，室溫避光放置15～20 min。取出加入 450 μL1×FACS 溶血素，充分混勻，避光放置15 min。24 h內上機，用MultiSET軟件獲取15000個細胞進行檢測。

1.2.2 CD4+CD25+調節性T細胞檢測方法：嚴格按照調節性T細胞檢測試劑盒說明書進行操作。流式細胞儀檢測分析應用CellQuest軟件，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，再以CD4和SSC設門選擇CD4陽性細胞分析，分析CD25和Foxp3表達，檢測結果分別以CD4+CD25+、CD4+CD25high和CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T細胞的百分率表示。以CD4+T細胞中表達CD25+熒光強度>CD4-T細胞中CD25+熒光強度者定義為CD4+CD25highT細胞。收集細胞數50000個/管。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 淋巴細胞亞群檢測結果

ITP組CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+的比值均顯著低于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.01）；CD8+T淋巴細胞百分比略升高，差異有統計學意義（P>0.05），CD19+B淋巴細胞百分比則顯著高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.01）；CD16+/56+NK細胞百分比顯著低于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.01），見表1。

2.2 ITP患者外周血CD4+CD25+、CD4+CD25high和CD4+CD25+Foxp3+T細胞的表達

實驗結果（表2）表明ITP患者外周血中CD4+CD25+T細胞占CD4+T細胞的百分比高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；同時檢測高表達CD25的CD4+T細胞（CD4+CD25high）和CD4+CD25+Foxp3+T細胞的數量變化。結果顯示ITP患者中CD4+CD25highT細胞比例略高于正常對照組，差異無統計學意義（P>0.05），而ITP患者CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例低于對照組（P<0.05），差異有統計學意義。

3 討論

T淋巴細胞在免疫反應中起重要作用，是細胞免疫的重要環節，按免疫應答中的功能不同，可將T細胞分成輔助性T細胞（helper T cell，Th）和抑制性T 細胞（T suppressor cell，Ts）。CD4+T 細胞是 T 輔助/誘導細胞的表面標志，具有輔助T細胞轉變成效應細胞、B細胞轉化成漿細胞以及活化巨噬細胞等功能。CD8+是抑制性T細胞/細胞毒性T細胞（cytotoxic T cell，Tc）的表面標志，能抑制 T 細胞活化、抑制B細胞產生抗體，起抑制細胞免抑和體液免抑的作用。細胞免疫與體液免疫相互促進，同時相互制約，T細胞比例失調必然導致B細胞的改變。CD19是與B細胞分化、活化、增殖及抗體產生的重要膜抗原，是鑒定B細胞的標志之一。CD16+56+是自然殺傷（natural killer，NK）細胞的特異性標志，NK 細胞對B細胞分化有抑制作用，能調節吞噬作用和抗體依賴細胞介導的細胞毒作用。

研究表明，Th/Ts細胞的平衡在自身免疫性疾病的發生、發展過程中起重要作用［3］。Th細胞是機體免疫應答的中心細胞，CD4+/CD8+細胞比值變化反應機體的免疫功能狀況，比例升高表明免疫功能亢進，比例降低表明免疫功能低下。淋巴細胞亞群檢測結果顯示ITP患者外周血NK細胞、CD3+T細胞、CD4+T細胞和CD4+/CD8+比值均顯著低于對照組，CD8+T細胞、CD19+B淋巴細胞高于對照組；以上結果與國內其他文獻報道相同［4，5］。T細胞功能異常導致B淋巴細胞激活，產生針對血小板的自身抗體可能是ITP的發病機制之一［6］。ITP患者CD19+B淋巴細胞的明顯升高提示B細胞活化可能是ITP抗血小板抗體產生的直接根源；另外ITP時NK細胞數量減少及活性降低，導致其對B細胞激活、增殖、分化和抗體應答的抑制能力下降，從而使B細胞異常活化，產生大量自身抗體，進而導致血小板的破壞增多。Johansson等［7］研究發現，激活的NK細胞能夠抑制ITP的自身免疫反應。

1995年Sakaguchi等［8］首次發現Treg細胞是一種專職抑制細胞，具有獨特免疫調節作用，并在動物實驗中將其去除后引發了多種自身免疫性疾病，而回輸后則可抑制上述疾病的發生。叉頭/翼狀螺旋轉錄因子（Fork-head/winged helix transcription factor，Foxp3）特異性地表達于Treg細胞，調節其發育、維持其功能，故被作為Treg細胞的特征性標記［9］。人類體內天然產生的Tregs來源于胸腺，占人外周血CD4+T細胞總數的5%～10%［10］。Treg細胞具有免疫無反應性和免疫抑制性兩大功能特征。免疫無能性主要表現在對IL-2特異性抗原及抗原提呈細胞（APC）的刺激呈低反應狀態，免疫抑制性則表現在TCR介導的信號刺激活化后能夠抑制CD4+和CD8+T細胞的活化和增殖。

我們觀察40例ITP患者外周血CD4+CD25+T細胞占CD4+T細胞的百分比，結果顯示較正常對照組明顯增多；與羅祖軍、孫雨梅等［11，12］報道的 ITP患者外周血CD4+CD25+T細胞百分率低于對照組有明顯差異。考慮到ITP患者存在自身反應性T細胞的異常活化，而CD25也是細胞活化標志，活化的CD4+T效應細胞表面也表達CD25分子，很難區分這兩群功能不相同的細胞，因此CD4+CD25+T細胞數量并不能代表真正的調節T細胞水平；如果實驗中直接按照外周血CD4+CD25+T細胞數量進行比較，由于混雜有一些活化T細胞在內，會對實驗結果的分析有影響。Clare等［13］發現人類外周血中高表達CD25的CD4+T細胞（CD4+CD25highT細胞）具有動物實驗中所觀察到的調節性T細胞所具有的低反應性及免疫抑制性的特性，而低表達CD25的CD4+T細胞卻不具備上述特性，故認為CD4+CD25highT細胞就是存在于人體內的調節性T細胞。然而本研究觀察到ITP患者外周血CD4+CD25highT細胞的比例并沒有減少，但CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T細胞比例卻明顯低于對照組。轉錄因子Foxp3可能是CD4+CD25+T細胞中主要的調節基因，是目前公認的CD4+CD25+Treg細胞的特異性標志，其他的淋巴細胞如CD4+CD25-T細胞、B細胞和CD8+T細胞僅表達少量的Foxp3。本研究在檢測Treg細胞時，以CD4+CD25+Foxp3+來識別Treg細胞，更準確地反映了ITP患者Treg細胞數量的變化。

Treg細胞數量減少使機體內免疫耐受平衡破壞，不能正常抑制T細胞的活化，使患者體內存在大量活化的T淋巴細胞參與血小板的損傷。Liu等［14］發現活動期和非緩解期ITP患者Treg細胞百分比明顯低于病情緩解期和健康人群。Sakakura等［15］研究認為抗血小板糖蛋白抗體陽性和病情嚴重的ITP患者Treg細胞數明顯降低，病情緩解后Treg細胞數上升，同時外周血單個核細胞的Foxp3-mRNA水平明顯增高。近來研究證實，Treg細胞通過抑制自身反應性T細胞的免疫反應，抑制T細胞的活化及促進某些抑制性細胞因子的分泌等，在自身免免疫性疾病的發生中發揮重要作用［16］。以上結果均提示ITP患者外周血Treg細胞比例降低，由此導致細胞免疫抑制功能缺陷，自身反應性T細胞活化，輔助B細胞產生自身抗體。由于ITP患者發病時體內Treg細胞水平降低，這提示我們可以以此為治療靶點，采取一些能夠提高Treg細胞水平及增強其功能的免疫療法，以扭轉患者體內的免疫紊亂，促進機體恢復。

本研究初步證實ITP發病機制中存在淋巴細胞免疫異常和免疫功能紊亂，淋巴細胞亞群水平和Treg細胞檢測的聯合使用對ITP的診斷及療效觀察有較好的實用價值。通過促進CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的增生分化，增強其免疫抑制功能，為有效運用免疫調節手段治療難治性ITP開辟了一條新途徑。

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