羅漢果超臨界CO2萃取工藝及揮發性成分分析

孔祥勇，劉煜宇，鄭琳，鄒由，李學杉

（云南瑞升煙草技術（集團）有限公司，云南 昆明 650106）

羅漢果 [Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey]為葫蘆科（cucurbitaceae）羅漢果屬植物，其果實又名拉漢果、紅毛果、羅幌子、假苦瓜等，是我國特有藥用植物，為衛生部首批公布的藥食兩用名貴中藥材，為傳統中藥和出口商品之一，是我國特有的珍貴葫蘆科植物，素有良藥佳果之稱。含大量葡萄糖和一種比砂糖甜300倍的羅漢果甙（三萜甙類），還含有D-甘露醇有清肺止咳作用[1-3]。主要產于廣西省桂林市臨桂縣和永福縣的山區，是桂林名貴的土特產。目前的相關文獻報導均主要是對其常規化學成分及提取的研究[4-7]，但鮮見采用超臨界CO2萃取優化工藝，并分析其化學成分的報道。

超臨界流體萃取技術（Supercritical fluid extraction，SFE）是近20多年發展起來的一項新型分離精制技術，工藝簡單，操作方便。超臨界CO2萃取在萃取植物有效成分時克服了溶劑提取法在分離過程中需蒸餾加熱，易氧化、酸敗等缺點，同時，具有萃取時間短，對萃取物選擇性高，無溶劑殘留等優點，廣泛應用于天然產物的提取中，特別適合于食品工業生物活性物質和熱敏性物質的分離提取。

本文以羅漢果提取率為考察指標，采用超臨界CO2萃取法，通過正交設計優化[8-11]確定了羅漢果有效成分的最佳提取條件，可為羅漢果的綜合開發發展提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

羅漢果（市售）,過20目篩的粗粉。

1.1.2 儀器

HA211-50-06超臨界流體萃取裝置：江蘇省南通市海安超臨界萃取有限公司；Agilent 6890N／5975氣相色譜－質譜聯用儀：美國安捷倫公司；HXC576血液冷藏箱：青島海爾特種電器有限公司；電子天平：上海梅特勒－托利多儀器有限公司；粉碎機：NK－505，中山市龍的電器實業有限公司；BUCHIR－3000型旋轉蒸發儀：瑞士BUCHI公司；SHZ－D（Ⅲ）循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.1.3 試劑

CO2（純度99.5%）：昆明梅塞爾公司；φ（乙醇）=95%（食品級）；無水硫酸鈉（AR）：廣東汕頭市西隴化工廠；二氯甲烷（AR）：天津市博迪化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超臨界CO2萃取工藝

稱取羅漢果粉末500 g并將其置于萃取釜中，夾帶溶劑為100 g φ（乙醇）=95%，設定萃取溫度，溫度穩定后通入CO2氣體，分別試驗萃取壓力、萃取溫度、CO2流量和萃取時間對羅漢果萃取物得率的影響。萃取結束后收集分離釜中的萃取物，使用旋轉蒸發儀減壓蒸餾，濃縮物即為羅漢果萃取物。

計算公式：萃取得率/%=羅漢果萃取物質量（g）/羅漢果粉末原料質量（g）×100。

1.2.2 正交試驗設計

超臨界CO2萃取羅漢果時，既要考慮產品的得率，又要考慮萃取速率和成本等因素，因此需要考察的工藝參數有萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、CO2流量和原料粒徑等。根據有關資料和預備單因素試驗，試驗選擇萃取壓力、萃取溫度、CO2流量和萃取時間作為主要影響因素，以測得羅漢果樣品得率為考察指標，進行L9（34）四因素三水平正交試驗，確定了對提取率影響最顯著的水平見表1，每次試驗重復2次。

表1 正交試驗因素水平表L9（34）Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

1.2.3 GC/MS分析條件

前處理：稱取1.00 g樣品，以10 mL二氯甲烷溶解，加入適量無水硫酸鈉置于4℃冰箱脫水12 h后過濾，濾液使用氣相色譜-質譜聯用儀進行檢測。

儀器檢測：毛細管柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）；進樣口溫度：240℃；載氣：He，恒壓模式70kPa；程序升溫：50℃（1 min）—8℃/min—160℃（2 min）—8 ℃/min—260 ℃（15 min）；進樣量：0.5μL；分流比：25∶1；傳輸線溫度：280 ℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：160℃；質量范圍35 aum～455 aum。溶劑延遲：2 min。

檢測模式：SCAN和SIM同步。

譜圖檢索：所得圖譜經計算機譜庫（NIST05,Wiley275）檢索，并結合標準質譜圖和有關文獻[12]，確定揮發性成分。并用色譜峰面積歸一化法測定得各揮發性成分的峰面積。

2 結果與討論

2.1 正交試驗數據分析

正交試驗結果見表2～表7。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 L9（34）正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of L9（34）orthogonal experiment

表4 因素A多重比較表（LSD法）Table 4 Multiple Comparisons（LSD）of Factor A

表5 因素B多重比較表（LSD法）Table 5 Multiple Comparisons（LSD）of Factor B

表6 因素C多重比較表（LSD法）Table 6 Multiple Comparisons（LSD）of Factor C

表7 因素D多重比較表（LSD法）Table 7 Multiple Comparisons（LSD）of Factor D

2.1.1 正交試驗結果的直觀分析

根據極差R的大小，可以看出各因素對羅漢果萃取物得率的影響程度依次為：A（萃取壓力）>C（CO2流量）>D（萃取時間）>B（萃取溫度）。

根據平均萃取率k的大小，可以看出萃取壓力A3時，萃取率最高。萃取溫度B2時，萃取率最高。CO2流量C2時，萃取率最高。萃取時間D2時，萃取率最高。因此，可以確定最佳萃取條件為A3B2C2D2，即萃取壓力30 MPa，萃取溫度45℃，CO2流量25kg/h，萃取時間3.0h。

2.1.2 正交試驗結果的方差分析和多重比較

方差分析結果表明，各因素對羅漢果萃取物得率的影響程度為：A（萃取壓力）、B（萃取溫度）、C（CO2流量）、D（萃取時間）影響都達到了極顯著程度（P<0.01）。

多重比較結果表明，A（萃取壓力）各水平之間差異極顯著（P<0.01）。B（萃取溫度）1和3水平之間差異不顯著（P>0.05），其余水平之間差異極顯著（P<0.01）。C（CO2流量）各水平之間差異極顯著（P<0.01）。D（萃取時間）1和3水平之間差異不顯著（P>0.05），其余水平之間差異極顯著（P<0.01）。因此，可以確定最佳萃取條件為A3B2C2D2，即萃取壓力30 MPa，萃取溫度45 ℃，CO2流量25 kg/h，萃取時間3.0 h。

為了進一步驗證該模型與測定可靠性，對最優實驗條件進行3次試驗驗證。在此條件下得到的羅漢果萃取物提取率平均值為10.08%，這說明該模型條件是比較可靠的。

2.2 羅漢果萃取物樣品的揮發性成分分析

2.2.1 羅漢果萃取物揮發性成分總離子流圖

羅漢果萃取物GC-MS揮發性成分的總離子流圖見圖1。

2.2.2 GC-MS分離鑒定出的羅漢果萃取物揮發性成分

羅漢果萃取物GC－MS揮發性成分的結果見表8。

據表8可知，羅漢果萃取物的揮發性成分共鑒定出55種化合物，所得質譜圖經計算機質譜數據庫檢測與標準圖譜核對，利用歸一化測定了各種成分的峰面積，其主要成分為：棕櫚酸（19.15%）、亞油酸（15.81%）、糠醛（11.06%）、苯乙醛（9.51%）、甘菊藍（3.32%）、4－環戊烯－1，3－二酮（3.28%）、2－乙酰基吡咯（3.17%）、5－甲基糠醛（2.04%）、亞油酸乙酯（1.87%）、鄰苯二甲酸單丁酯（1.42%）、2－乙基己酸（1.33%）、1－甲基吡咯－2－甲醛（1.12%）等。

3 結論

1）結合生產工藝、成本核算等多方面因素綜合考慮，超臨界CO2最佳萃取條件為A3B2C2D2，即萃取壓力30 MPa，萃取溫度45℃，CO2流量25 kg/h，萃取時間3.0 h。極差分析和方差分析的結果是一致的。

表8 羅漢果萃取物揮發性化學成分Table 8 The volatile compositions in the perfume of Siraitia grosvenorii flavor concret

續表8 羅漢果萃取物揮發性化學成分Continue table 8 The volatile compositions in the perfume of Siraitia grosvenorii flavor concret

2）揮發性成分分析分析結果表明超臨界CO2萃取工藝制備的羅漢果萃取物中含有大量的致香成分，如棕櫚酸、亞油酸、糠醛、苯乙醛等，還有多種脂肪酸類化合物和其它成分。

3）優選得到的超臨界CO2萃取工藝穩定、可行，通過該項研究為超臨界CO2提取技術在香精香料產品開發中的應用和開辟經濟、高效且定向生產特色羅漢果香原料的新途徑提供了參考。

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