微波輔助萃取洛龍黨參多糖的工藝優(yōu)化

余蘭，陳華，婁方明

（遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，貴州 遵義 563003）

黨參出典于《本草從新》，為桔梗科植物黨參[Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.]， 素 花 黨 參[Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen]或川黨參（Codonopsi tangshen Oliv.）的干燥根，是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥[1-3]。具有補(bǔ)中益氣，健脾益肺，用于脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消渴等病癥[4]。黨參的主要成分為多糖、皂甙、三萜醇、揮發(fā)油等，黨參多糖作為黨參功效成分之一，具有明確的增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗衰老等方面的藥理作用[5]。貴州省道真縣洛龍地區(qū)的洛龍黨參，是川黨參（Codonopsis tangshen Oliv.)的生態(tài)型變種，以肉質(zhì)根食用或入藥，又名單枝黨、條黨或蠻黨，與“文黨”、“潞黨”齊名，且營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味佳美，被視為菜肴中上品[6]。現(xiàn)代研究表明，黨參多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、防衰老以及抗疲勞等功效[7]，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療和保健行業(yè)，具有極大的開發(fā)和利用前景。所見文獻(xiàn)中對(duì)“文黨”、“潞黨”多糖研究的報(bào)道較多，而對(duì)“洛黨”多糖的文獻(xiàn)鮮見報(bào)道。

植物多糖的提取大多采用直接水煎煮法和有機(jī)溶劑（如乙醚、乙醇、石油醚等）脫脂后水煎煮法[8]，通常需要較長(zhǎng)時(shí)間的萃取。微波具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、加熱效率高等特點(diǎn)，微波輔助萃取技術(shù)已被應(yīng)用于多種植物成分的萃取[9-10]。本文中探討了微波輔助萃取法在洛龍黨參多糖中的應(yīng)用，并與傳統(tǒng)索氏提取法進(jìn)行了比較，取得了較好的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

HITACHI U3010紫外分光光度計(jì)：HITACHI公司；AL204電子天平：METTLER TOLEDO 公司；MAS-II型常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；FZ植物粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；Anke TGL-16C型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；艾柯DZG-303A型純水儀：成都唐氏康寧科技有限公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：TREECHEM公司；用水為二次蒸餾水；濃硫酸、苯酚、正丁醇、氯仿、乙醚、乙醇試劑均為分析純。

1.1.3 材料

洛龍黨參藥材，秋季挖取，洗凈，陰干（樣品由當(dāng)?shù)胤N植戶提供，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系生藥學(xué)教研室楊建文副教授鑒定為洛龍黨參（Codonopsis tangshen Oliv.)，粉碎，過60目篩，80℃干燥5 h備用。

1.2 洛龍黨參多糖的提取

精密稱取干燥洛龍黨參粉末10.0 g，置于1000 mL三頸燒瓶中，加入95%乙醇提取2次，離心取殘?jiān)厥找掖家海肧evag方法除蛋白2次，加適量蒸餾水，放置于MAS-II型常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站中，裝好冷凝管，按正交表設(shè)計(jì)方法進(jìn)行微波萃取。萃取結(jié)束后，離心取上清液，殘?jiān)盁坑脽崴礈?次（50 mL×3），洗液并入上清液在1000 mL容量瓶，蒸餾水定容至刻度，搖勻。精密吸取該樣品液5 mL于500 mL容量瓶中，稀釋至刻度線，冰箱中保存?zhèn)溆茫詼y(cè)定其濃度。

1.3 洛龍黨參多糖測(cè)定方法

1.3.1 5%苯酚溶液的配制

按文獻(xiàn)[11]進(jìn)行配制。

1.3.2 葡萄糖對(duì)照溶液的配制

精密稱取105℃干燥至恒重的對(duì)照品D-葡萄糖11.54 mg，加水溶解，定容至100 mL容量瓶中，得葡萄糖對(duì)照品備用液，濃度為115.40μg/L。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)D-葡萄糖溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液放入10 mL具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，同時(shí)吸取2 mL蒸餾水作為空白對(duì)照。然后分別加入1 mL 5%苯酚溶液，7 mL濃硫酸（控制在15 s～20 s內(nèi)完成），充分混勻后，迅速浸入沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，在分光光度計(jì)上掃描波長(zhǎng)從300 nm～760 nm之間的吸光度。在490 nm處有最大吸收，測(cè)其吸光度值，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，多糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理后，得回歸方程：A=0.0704C（μg/mL）+0.1245，R2=0.9997。

1.3.4 樣品多糖含量測(cè)定

用加樣槍從稀釋后的萃取液中取出1 mL，按照1.3.3，在490 nm處測(cè)其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求的洛龍黨參多糖得率，其計(jì)算公式為：多糖得率=洛龍黨參多糖含量/洛龍黨參原料重量×100%，即洛龍黨參多糖得率=CMV/W×100%。式中：C為樣品液吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出得含糖量，（μg/mL）；M為稀疏倍數(shù)，一般是50～250之間；V為樣品溶液的體積，mL；W為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 時(shí)間對(duì)洛龍黨參多糖得率的影響

萃取過程中，溫度過高時(shí)，多糖溶液很容易從冷凝管中沖出，造成試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)。選擇萃取溫度為70℃，保證黨參多糖能順利溶出，又防止溫度過高時(shí)多糖溶液沖出。準(zhǔn)確稱取10.0 g黨參，以二次蒸餾水為萃取劑，在相同的微波功率（400 W）、固液比[1∶40（g/mL）]、微波輻射溫度（70℃），萃取次數(shù)1次的條件下，對(duì)不同微波時(shí)間對(duì)微波輻射萃取洛龍黨參多糖得率的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果見表1所示。

表1 時(shí)間對(duì)洛龍黨參多糖得率的影響Table 1 The affection of time on the yield of polysaccharides

從表1可以得知，微波時(shí)間是影響多糖得率的一個(gè)重要因素，黨參多糖得率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。微波時(shí)間延長(zhǎng)，黨參中的多糖溶出增加，多糖得率提高。但微波輻射20 min后多糖的得率變化不大，綜合考慮試驗(yàn)進(jìn)度和能源因素，考察固液比和微波輻射功率對(duì)洛龍黨參多糖得率的影響時(shí)，選擇20 min作為微波萃取時(shí)間。

2.2 固液比對(duì)洛龍黨參多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取10.0 g黨參，以二次蒸餾水為萃取劑，固定萃取溫度為70℃，微波功率400 W，微波輻射時(shí)間20 min，萃取次數(shù)1次的條件下，分別用不同固液比例進(jìn)行萃取，結(jié)果見表2。

表2 固液比對(duì)洛龍黨參多糖得率的影響Table 2 The affection of solid/solvent ratio on the yield of polysaccharides

表2可以看出，固液比增大，洛龍黨參多糖得率增高，當(dāng)固液比為1∶40（g/mL），多糖得率最高。

2.3 微波輻射功率對(duì)洛龍黨參多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取10.0 g黨參，以二次蒸餾水為萃取劑，固定萃取溫度為70 ℃，固液比為1∶40（g/mL），微波輻照時(shí)間為20 min，萃取次數(shù)1次的條件下，考察不同微波輻射功率對(duì)洛龍黨參多糖得率的影響，結(jié)果見表3。

表3 微波輻射功率對(duì)洛龍黨參多糖得率的影響Table 3 The affection of radiation power on the yield of polysaccharides

由表3可以看出，洛龍黨參多糖得率開始隨微波輻射功率增大而增高，但當(dāng)功率增大到500 W以后，多糖得率有下降趨勢(shì)。

2.4 正交試驗(yàn)確定提取的最佳條件

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定微波時(shí)間、微波輻射功率和固液比作為考察因素，洛龍黨參多糖得率為指標(biāo)，應(yīng)用L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)研究，確定最佳提取工藝條件，因素水平見表4，試驗(yàn)結(jié)果見表5。據(jù)表5可知，根據(jù)極差的大小RB＞RA＞RC，所以影響微波輔助提取洛龍黨參多糖的主要因素是：固液比＞提取時(shí)間＞微波提取功率。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表6。

表4 正交試驗(yàn)所選因素和水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment design

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Table 5 Arrangement and results of L9（33）orthogonal experiments

2.5 試驗(yàn)因素對(duì)洛龍黨參多糖提取率影響的方差分析方差分析見表6。

表6 方差分析表Table 6 Analysis of variance

由表6方差分析結(jié)果可知，固液比對(duì)洛龍黨參多糖得率有顯著性影響，而微波時(shí)間和微波輻射功率對(duì)多糖得率無顯著影響。

通過正交試驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理考慮A、B、C三因素在3個(gè)水平上的變化，得出最佳提取條件。正交試驗(yàn)極差分析顯示，影響洛龍黨參多糖得率的主要因素是固液比，其次是微波時(shí)間和微波輻射功率，主次順序?yàn)锽＞A＞C；經(jīng)分析可知，B因子(固液比)是高度顯著的，根據(jù)K1、K2和K3的大小，最優(yōu)水平應(yīng)取B2，A是一般顯著的，最優(yōu)水平取A2，因子C的最優(yōu)水平取C3，于是最佳工藝條件選擇為A2B2C3，即在微波溫度為70℃，微波輻射功率600 W，微波時(shí)間25 min，固液比為1∶40的條件下洛龍黨參多糖得率為15.2%。

2.6 微波輔助萃取與傳統(tǒng)索氏萃取洛龍黨參多糖結(jié)果比較

精密稱取干燥洛龍黨參粉末10.0 g，加入400 mL的二次蒸餾水，置于1000 mL三頸燒瓶中，在溫度70℃時(shí)，分別置于索氏提取器和MAS-II型常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站中（微波輻射聲功率500 W）中，萃取時(shí)間20 min，其洛龍黨參多糖得率及其多糖含量見表7。

3 結(jié)論

1）對(duì)洛龍黨參多糖得率影響較大的因素是固液比，其次是微波輻射功率和微波時(shí)間。微波輔助萃取洛龍黨參多糖的最佳工藝條件是：微波萃取溫度70℃、微波時(shí)間25 min、微波輻射功率600 W、固液比為1∶40（g/mL）。

2）微波輔助萃取與常規(guī)索氏萃取法相比較，微波加熱的熱效率高，溫度升高快速而均勻，能夠使藥材中的有效成分得以充分釋出，縮短萃取時(shí)間，較大程度地提高多糖的萃取效率。采用微波輔助萃取洛龍黨參多糖具有提取時(shí)間短、提取得率高、簡(jiǎn)便、平行性好，操作成本低、節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)，值得推廣應(yīng)用。

表7 微波輔助萃取與傳統(tǒng)索氏萃取方法的比較（n=5）Table 7 Comparison of Microwave-assisted extraction to traditional Soxhlet extraction method

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