酶法制備乳源抗菌肽的抗菌性研究

陳婭嬌

（蒙牛（乳業(yè)）股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株逐年增多，目前金黃色葡萄球菌對青霉素G的耐藥菌株高達(dá)90%以上，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphyrlococcus aureus，MRSA）已經(jīng)成為醫(yī)院內(nèi)感染最常見的致病菌[1-4]。有些細(xì)菌甚至產(chǎn)生多重耐藥，如致病性大腸埃希菌約40%的菌株對鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素等多種抗生素產(chǎn)生耐藥性；銅綠假單胞菌對許多抗生素具有天然或獲得耐藥性，這給臨床治療帶來極大的困難，如何有效防治細(xì)菌感染及控制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與播散是一項長期、復(fù)雜、艱巨的任務(wù)，因而尋找和研制有效的抗菌藥物非常必要。抗菌肽（antibacterial peptide，ABP）是生物體天然免疫防御的重要組成部分，多數(shù)是一類相對分子量小于10 ku，由20～60個氨基酸殘基組成[5-7]。鏈長、序列及結(jié)構(gòu)是多樣性的陽離子型兩親性肽類。這類活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點。抗菌肽的制備方法主要有如下4種:從動植物組織中直接提取法、化學(xué)合成法、基因工程法和酶解法。由于酶作用本身的特點和固定化酶技術(shù)的應(yīng)用,酶解法具有成本低、安全性好、對設(shè)備條件要求不高、便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點,因而Bolscher等認(rèn)為酶解蛋白質(zhì)可能是大批量生產(chǎn)抗菌肽最有前途的方法。鑒于胰蛋白酶水解牛乳后產(chǎn)物中的抗菌肽具有高抗菌性,對G-、G+菌均有抑菌作用,且MIC值與乳酸鏈球菌肽（nisin）的抑菌作用相當(dāng)，為獲得具有廣譜抗菌活性的抗菌肽，本實驗以大腸桿菌（escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（staphy－lococcus aureus）、產(chǎn)氣芽孢桿菌（aer osis germ bacillus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、黑曲霉（aflatoxicosis）為實驗菌，在預(yù)備實驗確定的胰蛋白酶水解條件下研究了乳源抗菌肽抑菌活性的影響[8-11]。本文采用瓊脂擴(kuò)散法和試管連續(xù)稀釋法進(jìn)行體外抑菌實驗及最低抑菌濃度（MIC）的測定，以探討乳源抗菌肽對常見致病菌和條件致病菌的體外抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料來源

菌株來源為金黃色葡萄球菌（ATCC25923），乙型溶血性鏈球菌（ATCC25921），大腸埃希菌（ATCC25922），福氏志賀氏菌（ATCC27891）：由湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院提供。乳源抗菌肽液：由湖北工業(yè)大學(xué)膜技術(shù)研究所提供；乙醇，DPPH溶液，PBS溶液，硫酸亞鐵，三氯醋酸，亞硝酸鈉，硝酸鋁，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 乳源抗菌肽的制備

將脫脂奶粉配成10%的溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0，按酶與底物之比為0.025的比例加入胰蛋白酶，在37℃恒溫水浴，酶解15 min，然后用沸水浴滅酶活5 min，離心（10000 r/min）15 min，收集上清液。將所得上清液用小型超濾系統(tǒng)進(jìn)行分離，取5 ku～10 ku的肽段經(jīng)冷凍真空干燥備用[12]。

1.2.2 菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、福氏志賀氏菌接種于普通瓊脂平板上，置37℃溫箱中培養(yǎng)18 h，用無菌生理鹽水配成每毫升相當(dāng)于3億的菌濃度（金黃色葡萄球菌配成每毫升相當(dāng)于9億的菌濃度[13]。

1.2.3 瓊脂擴(kuò)散法

用無菌棉簽沾取菌液在普通瓊脂平板上作均勻密集劃線，待菌液干燥后，用外徑5 mm的打孔器打孔，每孔加藥液200 μL，平放在37℃溫箱中培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑取兩次實驗結(jié)果的平均值[14]。

1.2.4 試管連續(xù)稀釋法

根據(jù)抑菌實驗的結(jié)果，測定乳源抗菌肽溶液對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。取小號試管6支，編號。第一步每支管各加1 mL肉湯培養(yǎng)基。然后在第1管加1 mL藥液，用吸管在第1管吹吸數(shù)次，使藥液與肉湯培養(yǎng)基混勻，取出1 mL加于第2管，混勻取出1 mL加于第3管，如此稀釋至第5管棄去1 mL，第6管不加藥液作為對照。第三步每管加菌液50 μL，混勻，置37℃溫箱中培養(yǎng)24 h。然后從每管中取出一接種環(huán)接種于普通瓊脂平板上，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。以無細(xì)菌生長的最高稀釋濃度為該藥液的最低抑菌濃度。

1.3 抑菌方法

1.3.1 混合菌液的制備

將金黃色葡萄球菌，乙型溶血性鏈球菌，大腸埃希菌，福氏志賀氏菌混合在一起,然后稀釋配制成10個/mL的菌懸液，菌液按0.2 mL/平板（平板直徑為60.0 mm）的量均勻涂于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，再貼上無菌圓形濾紙（直徑為6.0 mm），在各紙片上分別滴加20 L抗菌肽溶液，4℃靜置3 h，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

1.3.2 單一性菌種溶液的制備

將金黃色葡萄球菌，乙型溶血性鏈球菌，大腸埃希菌，福氏志賀氏菌分別配制成10個/mL的菌懸液，菌液按0.2 mL/平板（平板直徑為60.0 mm）的量均勻涂于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，再貼上無菌圓形濾紙（直徑為6.0 mm），在各紙片上分別滴加20 L抗菌肽溶液，4℃靜置3 h，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

1.4 測定乳源抗菌肽對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、福氏志賀氏菌的最小抑菌濃度

配制濃度P分別為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL的乳源抗菌肽溶液，按1.3的方法進(jìn)行抑菌實驗，取抑菌圈最小時的濃度為最小抑菌濃度。

2 抑菌性研究結(jié)果

配制不同濃度的乳源抗菌肽溶液，其抑菌圈大小與濃度的關(guān)系如圖1所示。

圖1 乳源抗菌肽的濃度和抑菌圈直徑的對應(yīng)關(guān)系Fig.1 Milk-derived antimicrobial peptide concentration and the corresponding relationship between inhibition zone diameter

配制不同濃度的乳源抗菌肽溶液，鋪于培養(yǎng)皿上，菌落數(shù)與乳源抗菌肽溶液濃度關(guān)系如表1和表2所示。

表1 乳源抗菌肽對混合菌液的抑制情況Table 1 Milk-derived antimicrobial peptides in the inhibition of the mixed bacterial suspension

表2 乳源抗菌肽對單獨菌種溶液的抑制情況Table 2 Milk-derived antimicrobial peptides on the inhibition of a single bacterium

3 結(jié)論

1）乳源抗菌肽對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.125μg/mL，對乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、福氏志賀氏菌的最小抑菌濃度為0.25μg/mL；當(dāng)乳源抗菌肽的濃度為0.5μg/mL時,對金黃色葡萄球菌，乙型溶血性鏈球菌，大腸埃希菌，福氏志賀氏菌混合在一起的濃度為10個/mL的菌溶液有很好的抑菌效果。

2）實驗結(jié)果表明，乳源抗菌肽提取物對金黃色葡萄球菌，乙型溶血性鏈球菌，大腸埃希菌，福氏志賀氏菌有明顯的抗菌活性，但對金黃色葡萄球菌的抗菌活性強(qiáng)于大腸埃希菌，這可能是乳源抗菌肽的有效成分對不同病原菌的作用機(jī)理不同所致。由于乳源抗菌肽粗提物中含有多種化學(xué)成分，成分與藥理作用復(fù)雜，并且受多種因素的影響，本文只做了乳源抗菌肽的粗提液，有關(guān)乳源抗菌肽有效成分的提取與分析有待進(jìn)一步研究。

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