酶法制備乳源ACE抑制肽

于曉慶，王雄，司佳

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500；2.湖北工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430068）

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）在人體血壓調(diào)節(jié)過程中起重要作用。它催化血管緊張素I從C一端裂解二肽形成血管緊張素II，同時(shí)鈍化舒緩激肽，造成血壓升高。ACE抑制肽對(duì)ACE的親合度比血管緊張素I或舒張激肽要強(qiáng)，而且也不易從ACE結(jié)合區(qū)釋放。從而阻礙ACE催化血管緊張素I水解為血管緊張素II，催化舒緩激肽水解為失活片段，起降血壓作用。

牛乳蛋白是人類膳食蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，含有包括ACEI在內(nèi)的多種生物活性序列。乳源ACE抑制肽是當(dāng)前研究熱點(diǎn)，但加工過程中如何選擇合適的酶及控制酶解條件以獲得大量高活性ACE抑制肽是應(yīng)用關(guān)鍵。乳源ACE抑制肽以安全性高、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)在高血壓的防治中具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值，已成為國(guó)內(nèi)外科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。本文利用酶技術(shù)從牛乳蛋白中提取ACE抑制肽[1]。

1 材料與分析方法

1.1 材料與試劑

牛乳蛋白：青海雪峰耗牛乳業(yè)酪蛋白干酪素生產(chǎn)公司；胰蛋白酶：廣州明遠(yuǎn)工貿(mào)有限公司；蛋白酶A：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；木瓜蛋白酶：鄭州市綠邦科貿(mào)有限公司；胃蛋白酶：河南省可以化工有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）：長(zhǎng)春匯力生物有限公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）：上海亨代勞商貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

XW-80A型旋渦混合器：上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；755S型分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；pHS-4酸度計(jì)：上海偉業(yè)儀器廠；冷凍干燥機(jī)：杭州翔盛氣體設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ACE抑制活性的檢測(cè)方法

參照Nakamura方法，并作了修改，如反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)體系的大小、離心時(shí)間和速度、乙酸乙酯的萃取量等。

1.3.2 游離氨基酸的測(cè)定

取10 mL水解液加入30 mL去二氧化碳蒸餾水，混勻。用酸度計(jì)測(cè)其pH，用0.1 mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH8.2，加入甲醛溶液20 mL，1 min后，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，記錄消耗堿的體積V1（mL）；做空白實(shí)驗(yàn)并記錄消耗堿的體積V2（mL），則水解物的游離氨基酸濃度（mmol/mL）：

游離氨基酸濃度=M（V1-V2）×1000/10，式中：M為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，（mol/L）。

1.3.3 蛋白質(zhì)水解度（DH）的測(cè)定

采用pH-stat法。

1.3.4 乳蛋白源ACE抑制肽的精確制備

稱取一定量的牛乳蛋白，于pH7.4的磷酸鹽緩沖液溶解。置于恒溫水浴鍋中，當(dāng)水浴溫度達(dá)到水解溫度時(shí)，加入HCl或NaOH調(diào)至預(yù)定的pH，然后加入一定量的酶水解。在水解過程中不停地?cái)嚢?，并不斷加入適當(dāng)濃度的NaOH以維持pH在規(guī)定范圍（±0.05）內(nèi)，記錄加堿量和時(shí)間。到預(yù)定時(shí)間后，將反應(yīng)體系在沸水浴中保溫30 min，中止反應(yīng)。將水解物4000 r/min離心30 min，取沉淀冷凍干燥，然后精確稱取一定質(zhì)量的凍干粉進(jìn)行ACE抑制活性檢測(cè)。

1.3.5 半抑制濃度（IC50）的測(cè)定

稱取一定質(zhì)量的樣品，配制成不同濃度的溶液，測(cè)定其ACE抑制活性。以濃度為橫坐標(biāo)，抑制活性為縱坐標(biāo)繪制曲線，計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解用酶的選擇

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，分別在各種蛋白酶的最適溫度、pH條件下水解牛乳蛋白10 h。反應(yīng)結(jié)束后放在95℃的水浴鍋中保溫30 min使酶失活，然后離心得上清液。冷凍干燥后進(jìn)行ACE抑制活性測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 酶與抑制活性的關(guān)系Table 1 Relationship between enzyme and inhibitory activity

由表1可以看出，4種蛋白酶水解液的ACEI活性有明顯差異。蛋白酶A和木瓜蛋白酶水解全乳蛋白產(chǎn)生的ACEI活性較高。胃蛋白酶和胰蛋白酶水解液ACEI活性較低。而空白對(duì)照無(wú)ACEI活性。對(duì)表1中的ACE酶抑制劑進(jìn)行方差分析可知，胰蛋白酶與蛋白酶A，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶之間差異顯著。胃蛋白酶與木瓜蛋白酶，蛋白酶A，胰蛋白酶之間差異顯著。而蛋白酶A與木瓜蛋白酶差異不顯著。木瓜蛋白酶屬植物蛋白酶，其酶活力比其它蛋白酶低，水解速度慢。木瓜蛋白酶是以番木瓜未成熟果實(shí)的新鮮乳汁為原料，經(jīng)分離提取制得，價(jià)格相對(duì)較高，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇蛋白酶A作實(shí)驗(yàn)用酶[2]。

2.2 蛋白酶A酶解條件優(yōu)化

以蛋白酶A作為實(shí)驗(yàn)酶，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳的水解條件。由正交試驗(yàn)得出，各因素對(duì)ACE抑制活性指標(biāo)影響的主次順序：溫度>酶用量>pH>底物濃度。最佳反應(yīng)條件為：溫度52℃，酶用量3%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.5%，pH7。

2.3 水解時(shí)間的優(yōu)化

在一定條件下水解。分別抽取樣本，然后進(jìn)行冷凍干燥，分析ACE抑制活性，見圖1。

由圖1可知：水解過程中，ACE抑制活性隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高，當(dāng)水解時(shí)間到9.5 h左右時(shí)，ACE抑制活性達(dá)到最大值。當(dāng)繼續(xù)水解時(shí)，ACE抑制活性降低，這是由于水解時(shí)間延長(zhǎng)，讓已生成的ACE抑制肽部分被水解，生成活性較小或沒有活性的多肽。

2.4 水解過程中水解度、游離氨基酸含量的變化

水解過程中水解度、游離氨基酸含量的變化見圖2、圖3。

圖1 抑制活性與水解時(shí)間的關(guān)系Fig.1 Relationship between inhibitory activity and hydrolysis time

圖2 水解度與水解時(shí)間的關(guān)系Fig.2 Relationship betweeen degree of hydrolysis and hydrolysis time

圖3 游離氨基酸濃度與水解時(shí)間關(guān)系Fig.3 Relationship between dissociation amino acid density and hydrolysis time

由圖2可知，隨著水解時(shí)間的增加水解度不斷地增大，當(dāng)水解時(shí)間到9.5 h以后，水解度基本不再改變。由圖3可知，游離氨基酸濃度隨著時(shí)間的增長(zhǎng)先不斷地增大，然后保持穩(wěn)定，當(dāng)?shù)竭_(dá)9.5 h以后又開始繼續(xù)增長(zhǎng)。所以水解時(shí)間過長(zhǎng)，不利于提高ACE抑制活性。

2.5 半抑制濃度的測(cè)定

在比較各種食品來(lái)源的ACE抑制肽活性強(qiáng)弱時(shí)，IC50是最直觀的評(píng)價(jià)指標(biāo)。以ACE抑制活性為縱坐標(biāo)、酶解物的濃度為橫坐標(biāo)，繪制酶解物濃度與ACE抑制活性關(guān)系曲線，見圖4。

圖4 抑制活性與酶解物濃度的關(guān)系Fig.4 Relationship between inhibitory activity and hydrolysis density

由圖4可知，隨著酶解液濃度增大，抑制活性增大。但濃度達(dá)到某一特定值時(shí)，抑制活性保持穩(wěn)定。根據(jù)圖4曲線的性質(zhì)進(jìn)行二次回歸分析，其回歸方程為y=-6.9542x2+43.49x+12.691（R＝0.9995），由此推算出酶解液的IC50=1.0263 mg/mL。

3 結(jié)論

1）從4種蛋白酶中篩選出能夠產(chǎn)生具有較高ACE抑制活性的蛋白酶A，通過正交試驗(yàn)得出最佳反應(yīng)條件為：pH7、溫度52℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.5%、酶用量3%。通過單因素試驗(yàn)確定了最適酶解時(shí)間為9.5 h。

2）在蛋白酶解反應(yīng)過程中，隨著反應(yīng)時(shí)間的過度延長(zhǎng)，水解度略有增加，游離氨基酸含量大幅度增加，此時(shí)不利于增加其ACE抑制活性，反而會(huì)生成較多的游離氨基酸，不利于ACE抑制肽的生產(chǎn)。

3）乳源蛋白源ACE抑制肽的半抑制濃度為1.0263 mg/mL。

[1]姜瞻梅，霍貴成，呂桂善.不同食物來(lái)源的ACE抑制肽的研究現(xiàn)狀[J].食品研究與開發(fā)，2003，24(1)：27-29

[2]姜瞻梅，田波，吳剛，等.酶解牛乳酪蛋白制備ACE抑制肽的研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2007，7(6)：39-43

[3]李朝慧，羅永康，王全宇.乳清蛋白酶解制備ACE抑制肽的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2005，33(2)：8-11

[4]管驍，姚惠源.酶法制備燕麥麩蛋白ACE抑制肽的研究[J].食品與機(jī)械，2006，22(6)：12-14