超聲波輔助提取甘草總黃酮及其抗氧化性

鄒玉紅，寇小燕，韓秋霞

（山東科技大學(xué)，山東 青島 266510）

黃酮類化合物具有顯著的清除人體內(nèi)自由基、治療心血管疾病、抗心律失常、抗腫瘤，抗癌等藥理保健功能[1-2]。國內(nèi)外的研究表明，黃酮類化合物不僅具有多種生物學(xué)活性，而且具有劑量小、見效快、毒性低等優(yōu)點，所以在食品和醫(yī)藥保健領(lǐng)域的開發(fā)利用方面有著十分廣闊的前景。本試驗探討乙醇濃度、料液比、超聲功率、超聲時間4個因素對甘草總黃酮提取率的影響，以獲取提取甘草總黃酮的最佳工藝參數(shù)，并研究其抗氧化性，為甘草的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 材料與試劑

甘草莖切片：購于同仁堂大藥房；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、濃鹽酸、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、H2O2、水楊酸，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

超聲波細(xì)胞破碎儀（JY98-Ⅲ型）：寧波科生儀器廠；可見分光光度計（UNICO7200）：上海精密科學(xué)儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（101AB-1型）：龍口市電爐制造廠；電子天平（YP202N）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)（DL-5-B）：常州市科源電子電器廠。

2 方法

2.1 原料的預(yù)處理

將甘草于65℃下干燥24 h，磨粉機(jī)粉碎，過100目的篩，收集備用。

2.2 提取方法

取1 g的甘草粉末按照單因素試驗的條件用一定量的乙醇溶解20 min后，用超聲波法提取。提取物經(jīng)過離心后取上清，用乙醇補全體積。采用硝酸鋁比色法，測定提取物中的黃酮含量。

2.3 甘草總黃酮的含量測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品19.5 mg，加入80%乙醇適量配成濃度為0.975 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于20 mL刻度試管中，各加入5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，6 min后加入10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，放置6 min，加入5%NaOH溶液5 mL，混合均勻，15 min后用水定容至10 mL，用紫外-可見分光光度計在510 nm處測吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 總黃酮含量測定[2]

取0.6 mL提取液，測定其510 nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出比色液中總黃酮的含量，按下式計算甘草粉中甘草總黃酮的含量。

式中：y為提取液比色液的吸光值；V為提取液總體積，mL；v為移取提取液的體積，mL（本實驗過程中提取液顯色時未特別注明時取0.6 mL）；m為所稱甘草粉的質(zhì)量，g。

2.4 正交試驗[3]

經(jīng)過單因素初步預(yù)實驗后，以乙醇濃度、超聲頻率、超聲時間，料液比4個因素，取3個水平，設(shè)計L9（34）正交試驗，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，確定最佳提取工藝，因素水平如表1。

2.5 甘草總黃酮體外抗氧化性活性的研究

2.5.1 總黃酮對羥自由基（·OH）的清除作用

采用水楊酸法測定甘草黃酮對羥自由基的清除作用。在水楊酸體系中，水楊酸主要是起到顯色作用，可測得溶液中剩余自由基的含量，以此判斷抗氧化性。FeSO4和H2O2反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，羥自由基氧化水楊酸產(chǎn)生2，3-二羥基苯甲酸，由2，3-二羥基苯甲酸在510 nm處的吸光值確定羥自由基的多少，吸光值越大，表明羥自由基越多。在反應(yīng)體系中加入具有清除作用的物質(zhì)降低該吸光值，通過測定吸光值確定加入的物質(zhì)清除羥自由基效果。

表1 因素水平表Table 1 Factor level list

配制5份不同濃度的甘草黃酮溶液，取出2 mL于試管中，依次加入6 mmol/l FeSO4溶液2 mL，6 mmol/L H2O22 mL，搖勻后靜置10 min。加入6 mmol/L水楊酸2 mL，搖勻后靜置30 min，測定510 nm下吸光度，記為Di。用水代替水楊酸測定某濃度黃酮溶液的本底光密度Dj。用水代替抗氧化劑時測定的空白對照光密度D。

2.5.2 總黃酮對超氧自由基（O2-·）的清除作用[4]

采用鄰苯三酚自氧化法，取50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH8.2）4.5mL，加入4.2mL去離子水，混勻后25℃水浴保溫20 min。再25℃水后立即倒入比色皿中，于325 nm處每隔30 s測A值1次，共5 min。計算對照溶液吸光度隨時間的變化率Fr。再依上法試驗，在加入鄰苯三酚前加入1.0 mL甘草黃酮溶液，再加入3.2 mL去離子水，混勻25℃水浴保溫20 min，取出后立即加入再25℃預(yù)熱過的3 mmol/L的鄰苯三酚0.3 mL，混勻，于325 nm處每隔30 s測A值1次，共5 min。計算黃酮溶液吸光度隨時間的變化率Fx。

清除率S=（Fr-Fx）/Fr×100%

3 結(jié)果

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(c，mg/mL)與吸光度（A）進(jìn)行線性擬合，得線性回歸方程為y=10.404x-0.0209，R2=0.9943。式中：x為總黃酮（蘆?。┖?；y為吸光值A(chǔ)。

3.2 總黃酮最佳提取條件的確定

正交試驗結(jié)果和方差分析見表2。

結(jié)果顯示四因素對甘草總黃酮提取的影響主次順序為乙醇濃度、料液比、超聲頻率、超聲時間。最佳提取條件為A2B3D2C3，即：乙醇濃度為75%、料液比為1∶25、超聲頻率為350 W，超聲時間為25 min。在此條件下總黃酮得率為1.943%。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiments

3.3 甘草總黃酮的抗氧化活性研究

3.3.1 甘草總黃酮對羥自由基（·OH）的清除作用的結(jié)果

甘草總黃酮對羥自由基（·OH）的清除作用，結(jié)果見圖1。

圖1 甘草總黃酮對羥自由基（·OH）的清除Fig.1 The effect of flavonoids to clear hydroxyl radical（·OH）

由圖1可知，甘草總黃酮對羥自由基具有清除作用。在一定濃度范圍內(nèi)，甘草總黃酮對羥自由基的清除能力隨濃度的增加而增大。當(dāng)溶液濃度達(dá)到1.1296 mg/mL時，對羥自由基（·OH）的清除率達(dá)到了55.73%。

3.3.2 甘草總黃酮對超氧自由基（O2-·）的作用的結(jié)果

甘草總黃酮對超氧自由基（O2-·）的清除作用，結(jié)果見圖2。

圖2 甘草總黃酮對超氧自由基（O2-·）的清除Fig.2 The effect of flavonoids to clear superoixide radical（O2-·）

由圖2可知，甘草總黃酮對鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2-·有抑制作用，其清除率隨濃度的增大而增大，表明其抑制能力與濃度呈明顯的量效關(guān)系。當(dāng)溶液濃度達(dá)到1.1296 mg/mL時，甘草總黃酮對超氧自由基（O2-·）的清除率達(dá)到50%。

4 結(jié)論

本實驗采用正交試驗方法，確定了甘草總黃酮的最佳提取工藝：乙醇濃度為75%、料液比為1∶25、超聲頻率為350 W，超聲時間為25 min。最終總黃酮得率為1.943%。同時通過對自由基的清除作用研究，證實了甘草總黃酮是一種有效的自由基清除劑。甘草總黃酮對羥自由基和超氧自由基有顯著的清除作用，且清除作用隨濃度和時間的增大而增強，由此可知甘草總黃酮是一種天然有效的自由基清除劑，具有一定的抗氧化性。本研究提取的甘草總黃酮可以廣泛應(yīng)用于食品和藥品行業(yè)中，具有廣闊的開發(fā)前景，為實現(xiàn)甘草深加工提供了一種新的途徑。

[1]曾超珍,劉志祥,吳耀輝，等.超聲波提取甘草黃酮及其抑菌活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(10):2402-2403

[2]孫蕓，阿依努爾·吾買爾，燕雪花，等.甘草黃酮的提取方法及藥理作用研究進(jìn)展[J].新疆中醫(yī)藥，2009,27(7):72-75

[3]嚴(yán)贊開.紫外分光光度法測定植物黃酮含量的方法[J].食品研究與開發(fā),2007,28(9):164-165

[4]逯家輝,姜鑫,李昊龍，等.應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波法提取甘草中總黃酮的工藝[J].吉林大學(xué)學(xué)報：工學(xué)版,2008,38(2):292-298

[5]王桃云，陳鵬，董五科，等.超聲波提取豆莢總黃酮優(yōu)化工藝與抗氧化性研究[J].中國糧油學(xué)報，2009,24(6):114-117