油菜蜂花粉蛋白的分離提取及其抗氧化活性*

鄧建軍，楊海霞，曹煒，程妮，王畢妮，高慧

1(西北大學食品科學與工程系，陜西西安，710069)2(西安交通大學醫學院公共衛生系營養與食品衛生學學科，陜西西安，710061)

油菜蜂花粉蛋白的分離提取及其抗氧化活性*

鄧建軍1，楊海霞2，曹煒1，程妮1，王畢妮1，高慧1

1(西北大學食品科學與工程系，陜西西安，710069)2(西安交通大學醫學院公共衛生系營養與食品衛生學學科，陜西西安，710061)

以油菜蜂花粉為研究對象，根據溶解性的不同，從中分離出了水溶性蛋白、醇溶性蛋白、堿溶性蛋白及鹽溶性蛋白，并對各蛋白組分抗氧化活性進行了研究。結果表明:油菜蜂花粉中主要蛋白為水溶性蛋白，占其干重的7.35%，其次為醇溶性蛋白3.65%，鹽溶性蛋白和堿溶性蛋白分別占2.50%和2.24%。4種不同溶解性的油菜蜂花粉蛋白均具有一定的體外抗氧化作用，各蛋白組分的總抗氧化能力以及對DPPH自由基、OH·和·的清除能力呈現較好的量效關系;4種蛋白抗氧化活性由強到弱的順序依次為水溶性蛋白＞醇溶性蛋白＞堿溶性蛋白＞鹽溶性蛋白。因此，油菜蜂花粉蛋白質可作為一種潛在的天然抗氧劑進行深入研究。

油菜，蜂花粉，蛋白質，提取分離，抗氧化活性

蜂花粉是蜜蜂在采集花粉的過程中，加入一些花蜜和唾液，使其黏集成團，經過一系列的生物化學變化而形成的易于吸收的花粉團。蜂花粉是目前國際公認的天然營養保健食品之一［1－2］。

蜂花粉中含有豐富的營養成分，如必需氨基酸、蛋白質、不飽和脂肪酸、多糖、維生素和微量元素，還含有對人體生理機能有特殊功效的黃酮類、核酸、天然植物激素、性激素和促性腺激素等多種生物活性物質［1－2］。除此之外，蜂花粉中還含有 100多種酶，如過氧化物酶、過氧化氫酶及超氧化物歧化酶等［3］。研究表明，蜂花粉具有增強人體免疫功能、延緩衰老、改善消化道功能、抗疲勞、抑制前列腺增生和治療便秘等許多生理功能［4］，其中絕大多數功能與蜂花粉的抗氧化作用有著密切的關系。關于蜂花粉抗氧化作用的研究一直是該領域研究的焦點，國內外許多學者認為正是由于蜂花粉含有大量的多酚以及黃酮類物質，才使得蜂花粉具有了很強的抗氧化活性［5－6］。本文以油菜蜂花粉為材料，采用不同溶劑對其蛋白質進行分離提取，同時對各種蛋白質組分的抗氧化活性進行測定，以期為擴大蜂花粉產品的深加工以及揭示蜂花粉抗氧化作用機理提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

油菜蜂花粉，由陜西老峰農生物有限責任公司提供;牛血清蛋白(美國Amresco公司，純度≥99%的分析純);硫代巴比妥酸(TBA)、D-脫氧核糖、考馬斯亮藍R-250、三吡啶三吖嗪(TPTZ)、N，N-二苯基三硝基苯肼(DPPH)、氯化硝基四唑藍(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)和還原型輔酶 I(NADH)，均為 Sigma-Aldrich Co.產品;其余試劑均為國產分析純。

HH-2數顯恒溫水浴鍋(常州國華儀器有限公司)，DF-101B集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海一基實業有限公司)，FD-1冷凍干燥機(北京博醫康技術公司)，QG超純水制備儀(美國Millipore公司)，超濾裝置(美國Millipore公司)，KQ-100B恒溫超聲波清洗機(上海實驗儀器廠有限公司)，飛鴿牌LXJ-IIB離心機(上海安亭科學儀器廠)，KDY-9830自動凱氏定氮儀(KETUO公司)，UV751GD紫外可見分光光度計(蘇州江東精密儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 花粉的破壁

采用溫差破壁法，參考胡筱波等［7］方法。將花粉除去泥沙、蜂足和草枝等雜物，然后研磨，置于－20℃以下冷凍約24 h，取出并迅速加入90～95℃熱水中(比例為3 g∶1 mL)攪拌約10 min，然后迅速冷卻到40℃左右保持6～8 h，冷凍干燥得破壁花粉，4℃貯藏待用。

1.2.2 油菜蜂花粉粗蛋白的分離、提取及含量的測定

1.2.2.1 水溶性粗蛋白的制備

在20 g破壁凍干的油菜蜂花粉樣品中，加入400mL的去離子水，4℃下攪拌提取8 h，抽濾，用少量的蒸餾水分3次洗滌殘渣，抽濾至干，濾液添加(NH4)2SO4至80%的飽和度，4℃靜置12 h，4 800 g離心30 min，棄上清液，沉淀用50 mmol/L PBS(pH 7.4)緩沖液溶解，然后用截留分子質量為3 000 u的超濾膜進行超濾，重復3次，所得蛋白溶液真空冷凍干燥，－20℃保存待用。

1.2.2.2 鹽溶性粗蛋白的制備

在上述水溶液提取的殘渣中，加入400 mL 0.5 mol/L NaCl溶液，4℃下攪拌提取8 h。接下來的步驟除了(NH4)2SO4為40%以及沉淀溶解在0.5 mol/L NaCl溶液之外，其余均與1.2.2.1相同。

1.2.2.3 醇溶性粗蛋白的制備

在上述NaCl溶液提取的殘留物中，加入200 mL體積分數75%乙醇，4℃下攪拌提取8 h，將其提取液抽濾至干。濾液中加入400 mL的去離子水，4℃靜置12 h，4 800 g離心30 min。沉淀用體積分數75%乙醇溶解后，4℃下用去離子水透析24 h后，進行冷凍干燥，－20℃保存待用。1.2.2.4 堿溶性粗蛋白的制備

在上述乙醇溶液提取的殘渣中，加入400 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，4℃下攪拌提取8 h。接下來的步驟除了(NH4)2SO4為40%以及沉淀溶解在0.1 mol/L NaOH溶液之外，其余均與1.2.2.1相同。

1.2.2.5 蛋白質含量的測定

總蛋白含量采用凱氏定氮儀測定;各組分蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定［8］，以牛血清蛋白作為標準。

1.2.3 油菜蜂花粉粗蛋白抗氧化活性的測定

將油菜蜂花粉水溶性粗蛋白、鹽溶性粗蛋白、醇溶性粗蛋白及堿溶性粗蛋白分別用去離子水、0.5 mol/L NaCl溶液、體積分數75%乙醇和0.1 mol/L NaCl溶液配制成不同濃度的蛋白溶液進行抗氧化活性比較分析。

1.2.3.1 鐵還原抗氧化能力(FRAP)測定

參照 Benzie和 Strain 的方法［9］，略做修改。FRAP工作液包括:300 mmol/L醋酸緩沖液(pH 3.6)、10 mmol/L TPTZ鹽酸溶液(鹽酸濃度為40 mmol/L)和20 mmol/L FeCl3種溶液按照 1∶1∶10 的體積比混合。此工作液現用現配，使用前在37℃水浴中保溫。取4.5 mL FRAP工作液，加入不同濃度的樣品溶液0.1 mL，再加入3.4 mL去離子水，混合均勻后置于37℃水浴中反應30 min，然后測定593 nm處的吸光值，吸光值越大表示樣品抗氧化性越強，以提取試劑作為空白對照。結果以Fe2+當量表示(mmol Fe2+/100 g)。

1.2.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

參照LeBlanc等人方法［10］，并作修改。將不同濃度的4種油菜蜂花粉蛋白樣品0.5 mL加入到9.5 mL濃度為40 μg/mL DPPH無水甲醇溶液中，迅速混合均勻后避光靜置30 min，然后測定517 nm處的吸光值，以不加樣品為空白對照，按照以下公式計算DPPH自由基清除率:

其中:A樣品和A對照分別表示樣品和對照在517 nm處的吸光度)。

1.2.3.3 羥基自由基(OH·)清除能力的測定

采用D-脫氧核糖法［11］測定OH·清除能力。向10 mL的試管中依次加入0.4 mL pH 7.4的PBS緩沖液(50 mmol/L)、0.1 mL的樣品溶液、0.1 mL Vc(2 mmol/L)、0.1 mL H2O2(12 mmol/L)、0.05 mL D-脫氧核糖(8 mg/L)、0.1 mL(1 mmol/L EDTA)、0.1 mL FeSO4(1 mmo/L)，然后用PBS緩沖溶加至2 mL，反應物置于37℃水浴中30 min，每5 min振蕩一次，取出后迅速加入1 mL 10%TCA和1 mL 1%TBA，沸水水浴15 min，立即冷卻，若有渾濁，離心取上清液，以PBS緩沖溶液為空白對照，在532 nm處測其吸光度，按照以下公式計算OH·清除率:

其中:A樣品和A對照分別表示樣品和對照在532 nm處的吸光度)。

1.2.3.4 超氧自由基(O2－·)清除能力的測定

采用NBT法［12］測定O2－·清除能力。將不同濃度的樣品溶液加入到NBT反應液(包括0.1 mmol/L PMS、1 mmol/L NADH和1 mmol/L NBT溶解于0.1 mol/L pH 7.4 PBS緩沖液中)中，室溫下［(25±1)℃］反應5 min，以PBS緩沖溶液為空白對照，在560 nm處測其吸光度，按照以下公式計算O2－·清除率:

其中:A樣品和A對照分別表示樣品和對照在560 nm處的吸光度)。

1.2.4 統計分析

采用Microcal Origin7.5軟件(Microcal Softwere，Inc.，USA)進行數據處理、作圖，采用SPSS10.0軟件(SPSS Inc，USA)進行數據分析，差異性采用Turkey法進行多重比較，置信水平95%(P=0.05)，所有試驗至少重復3次。

2 結果與分析

2.1 四種溶劑對油菜蜂花粉蛋白提取效果的影響

對油菜蜂花粉蛋白采用不同溶劑進行逐級分離提取，得到的各組分蛋白質含量圖1所示(圖1中不同字母表示樣品之間有顯著性差異)。結果顯示，溶劑不同所得到的蛋白質含量也明顯不同，其中水溶性蛋白是含量最高，約占花粉干重的7.4%，與其他3種蛋白在含量上存在顯著性差異，分別是醇溶性蛋白的2.0倍、鹽溶性蛋白的2.9倍及堿溶性蛋白的3.3倍。4種可溶性蛋白占油菜花粉干重的15.7%，占總蛋白含量的64%(凱氏定氮法測得總蛋白含量為24.6%)。

圖1 四種溶劑對油菜蜂花粉蛋白提取效果的影響

2.2 油菜蜂花粉蛋白的鐵還原抗氧化能力比較分析

FRAP法具有操作簡單以及結果重復性好等特點，被廣泛應用于許多食品成分總抗氧化能力的分析中［9］。對不同溶解性的油菜蜂花粉蛋白總抗氧化活性采用FRAP法測定結果表明，4種蛋白均具有不同程度的鐵離子還原能力，且隨著蛋白濃度的增加，FRAP值也逐漸增大(如圖2所示)。其中水溶性蛋白鐵離子還原能力最強，其次為醇溶性、堿溶性，鹽溶性最小，例如，當蛋白質濃度為0.8 mg/mL時，水溶性蛋白FRAP值為2.54 mmol Fe2+/100g，分別是醇溶性蛋白的1.7倍、堿溶性蛋白的4.0倍及鹽溶性蛋白的6.4倍。FRAP值越大說明反應體系中抗氧化劑的抗氧化能力越強，由此可知，油菜蜂花粉蛋白中存在有未知的抗氧化活性蛋白，且水溶性蛋白中抗氧化蛋白含量最高，與蛋白的抗氧化能力表現出了良好的正相關。由于蛋白在提取過程中采用3 000的超濾膜進行了處理，各蛋白組分所表現出的抗氧化活性排出了多酚類物質以及小分子抗氧化活性肽的可能性。該試驗結果初步說明從油菜蜂花粉中提取天然的抗氧化活性蛋白是可行的。有待于從自由基清除力的角度進一步研究各蛋白組分抗氧化活性。

圖2 不同溶解性油菜蜂花粉蛋白的鐵還原抗氧化能力比較

2.3 油菜蜂花粉蛋白對DPPH自由基的清除能力

DPPH作為一種非常穩定的質子自由基，當體系中存在抗氧化物質時由于單電子配對使其吸收減少，故可通過測定DPPH自由基含量的變化可評價抗氧化物質的抗氧化能力，目前已經被普遍使用［13］。本研究對四種不同溶解性的油菜蜂花粉蛋白的DPPH自由基清除能力的測定結果如圖3所示。在0.2～1.0 mg/mL內，4種粗蛋白均具有不同程度清除DPPH自由基的能力，隨著濃度的增加，各種蛋白組分DPPH自由基清除能力也逐漸增強，呈劑量依賴性關系;相同質量濃度下，4種蛋白組分的DPPH自由基清除率的順序依次為水溶性蛋白＞醇溶性蛋白＞堿溶性蛋白＞鹽溶性蛋白。例如，在蛋白濃度為1 mg/mL時，水溶性蛋白的DPPH清除率達69.8%，比醇溶性、堿溶性及鹽溶性蛋白的清除率分別高出為17.5%、25.5%和28.6%。

圖3 不同溶解性油菜蜂花粉蛋白對DPPH自由基的清除能力

2.4 油菜蜂花粉蛋白對OH·的清除能力

OH·是一種普遍存在于機體的活性氧自由基，反應活性極強，許多物理、化學因子損傷都會促進其形成，是造成機體過氧化損傷的主要誘發因子［14］，因此，尋找天然的清除OH·的抗氧化劑非常有必要。試驗中采用D-脫氧核糖法比較不同溶解性的油菜蜂花粉蛋白對OH·的清除能力，結果表明，各蛋白組分均具有不同程度的清除OH·的能力，且清除率隨著樣品濃度的增加而增大，表現出良好的量效關系(如圖4所示)。當蛋白濃度≤0.4 mg/mL時，醇溶性與堿溶性蛋白對OH·的清除率相當，水溶性蛋白對OH·的清除率遠高于其他3種蛋白;當蛋白濃度＞0.4 mg/mL時，4種蛋白對OH·的清除率表現出明顯的差異，相同質量濃度下，4種蛋白組分對OH·的清除率與對DPPH自由基清除率的順序一致，即:水溶性蛋白＞醇溶性蛋白＞堿溶性蛋白＞鹽溶性蛋白。例如，蛋白濃度為1 mg/mL時，水溶性、醇溶性、堿溶性及鹽溶性蛋白對OH·的清除率分別為75.8%、55.3%、46.3%和35.2%。

圖4 不同溶解性油菜蜂花粉蛋白對OH·的清除能力

3 結論與展望

采用不同溶劑對油菜蜂花粉蛋白進行分離提取，發現水溶性蛋白是油菜蜂花粉蛋白質的主要組分，約占花粉干重的7.35%，醇溶性蛋白次之，鹽溶性蛋白和堿溶性蛋白含量最少。通過對不同溶解性的油菜蜂花粉蛋白抗氧化活性測定，發現4種蛋白均具有鐵離子還原能力以及對DPPH自由基、OH·和O－2·也具有較強的清除能力，且與蛋白質濃度呈現良好的量效關系。四種蛋白抗氧化活性順序依次為:水溶性蛋白＞醇溶性蛋白＞堿溶性蛋白＞鹽溶性蛋白。

目前，研究者普遍認為這些功能大多與蜂花粉中的黃酮、多酚及小分子活性肽的抗氧化作用有著密切的關系。而本研究發現油菜蜂花粉中的可溶性蛋白質也具有較好的抗氧化活性，尤其以水溶性蛋白質的抗氧化活性最強，因此，油菜蜂花粉蛋白可作為一種潛在的天然抗氧劑進行開發研究。同時，分離鑒定具有抗氧化功能的目標蛋白質并揭示其抗氧化機理也是非常值得我們去探究的新課題。

圖5 不同溶解性油菜蜂花粉蛋白對·的清除能力

［1］ Kenneth R M，Maria C.7-and 8-O-methylherbacet in-3-O-sophorsides from bee pollens and some structure/activity observations［J］.Phytochemistry，1996，43(4):763 －767.

［2］ Almeida-Muradlan L B，Lucila C P，Sikvia C，et al.Chemical composition and botanical evaluation of died bee pollen pellets［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2005，18:105－111.

［3］ 程道梅.蜂花粉營養成分及其在老年營養保健中的作用［J］. 中國食物與營養 2011，17(3):85－88.

［4］ 于學玲，朱榮譽，史勁松.蜂花粉的開發及其破壁技術［J］. 中國野生植物資源，1998，17(4):33－33.

［5］ Almaraz-Abarca N，da Graca Campos M，Avila-Reyes J A，et al.Antioxidant activity of polyphenolic extract of monofloral honeybee-collected pollen from mesquite(Prosopis juliflora，Leguminosae) ［J］.Journal of Food Compo-sition and Analysis，2007，20:119－124.

［6］ 程妮，高慧，王畢妮，等.松花粉提取物抗氧化活性及其酚類化合物研究［J］.食品與發酵工業，2011，37(5):118－122.

［7］ 胡筱波，徐明剛，吳謀成，等.溫差破壁法對油菜蜂花粉中主要營養素含量的影響［J］.食品科學，2005，26(10):120－124.

［8］ Bradford M M.A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding ［J］.Analysis Biochemistry，1976，72:248－254.

［9］ Benzie I F F，Strain J J.The ferric reducing ability of plasma as a measure of‘antioxidant power’:The FRAP assay［J］.Analytical Biochemistry，1996，239:70 －76.

［10］ LeBlance B W，Davis O S，Boue S，et al.Antioxidant activity of Sonoran Desert bee pollen［J］.Food Chemistry，2009，115:1 299－1 305.

［11］ Barry H，John M，Okezie I.The deoxyribose method:A simple‘Test-Tube’assay for determination of rate constants for reactions of hydroxyl radicals ［J］.Analytical Biochemistry，1987，165:215－219.

［12］ Srivastava A，Shivanandappa T.Antioxidant and cytoprotective properties of 2-(hydroxymethyl)-3-methoxybenzaldehyde［J］.Food Chemistry，2011，128(2):458 －464.

［13］ Xu B，Yuan S，Chang S.Comparative analyses of phenolic composition，antioxidant capacity，and color of cool season legumes and other selected food legumes ［J］.Journal of Food Science，2007，72:167－177.

［14］ Yang J，Lin H，Mau J.Antioxidant properties of several commercial mushrooms［J］.Food Chemistry，2002，77(2):229－235.

Study on Extraction and Antioxidant Activity Analysis of Rape Bee Pollen Protein

Deng Jian-jun1，Yang Hai-xia2，Cao Wei1，Cheng Ni1，Wang Bi-ni1，Gao Hui1
1(Department of Food Science and Technology，Northwest University，Xi’an 710069，China)2(Department of Nutriology and Food Sanitation，Medical School of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China)

In this paper，rape bee pollen was used as the research object.Four types of rape bee pollen protein，including water-soluble，ethanol-soluble，salt-soluble and alkali-soluble protein were extracted by their different dissolving abilities.The antioxidant activities were investigated.The results showed that the contents of water-soluble protein，ethanol-soluble protein，alkali－soluble protein and salt-soluble protein were 7.35%，3.65%，2.50%，and 2.24%，respectively.All four protein components from rape bee pollen had antioxidant activity.The relationship between concentration and the total antioxidant power，the scavenging power on DPPH，OHo，and O-2o all showed positive correlation with the concentration.Antioxidant activity from strong to weak was in the following order:water-soluble protein＞ethanol-soluble protein＞alkali-soluble protein＞salt-soluble protein.Therefore，rape bee pollen proteins have the potential as natural antioxidant.

rape，bee pollen，extraction，antioxidant activity

博士，講師。

*西北大學校內基金(NG10002);西北大學科研啟動金(PR10037)

2011－07－13，改回日期:2011，09－22