甘薯葉總黃酮含量的測定*

李光，余霜，鄧銀，陳慶富

1(安順學院化學與生物農學系，貴州安順，561000) 2(安順學院資源管理與環境科學系，貴州安順，561000)3(貴州師范大學生命科學學院，貴州貴陽，550001)

甘薯葉總黃酮含量的測定*

李光1，3，余霜2，3，鄧銀3，陳慶富3

1(安順學院化學與生物農學系，貴州安順，561000) 2(安順學院資源管理與環境科學系，貴州安順，561000)3(貴州師范大學生命科學學院，貴州貴陽，550001)

為了研究甘薯葉總黃酮含量測定方法，文中采用超聲波輔助提取甘薯葉中的總黃酮，通過波長掃描確定了AlCl3-KAC顯色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法的最大吸收峰波長分別為360nm和500nm;比較了分光光度法2種空白對照的制作方法對實驗結果的影響，最終根據測量值的標準誤差、標準差、方差、峰度、偏度等指標確定最適顯色法。結果表明:波長在500 nm處以蒸餾水為空白的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法是甘薯葉總黃酮含量測定的最適方法，該法穩定性好，操作簡便，對甘薯其他部位總黃酮含量測定有較好的參考價值。

甘薯，黃酮含量，測定方法

甘薯，又稱紅薯、番薯和地瓜，屬旋花科植物，原產于美洲中部和南美洲西北部的熱帶地區［1］。現廣泛種植于中國各地，目前中國甘薯的常年種植面積占世界總種植面積的80%以上。甘薯通常以食用塊根為主，我國每年近億噸的甘薯莖葉(除部分地區作為飼料外)多數被拋棄掉，造成資源浪費和環境污染。所以、對甘薯藤葉進行資源化利用，有較好的社會效益和經濟價值。

黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物，是植物在長期自然選擇過程中產生的一類次生代謝產物。它能清除生物體內的自由基，具有抗氧化作用［1］。關于黃酮類物質的測定，常采用比色法和HPLC法。由于HPLC法儀器昂貴，標準對照物的較難獲得，其應用受到一定的限制。而比色法方便簡單，結果準確，應用較廣，黃酮測定用到的分光光度法主要有AlCl3-KAC顯色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法2種，但是在已有報道中，這2種方法都被用于甘薯黃酮測定，本研究通過對2種分光光度法的比較，確定了甘薯葉的總黃酮最適測定方法，取得了滿意的實驗結果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘薯葉，采自貴州師范大學植物遺傳育種研究所。蘆丁標準品，購自貴州迪大生物有限公司;其他試劑為分析純。

DHG-90A(101AB)干燥箱，上海索譜儀器有限公司;紫外可見分光光度計 UV-1800，島津公司;AR1140電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司;WB-400小型高速粉碎機，北京維博創機械設備有限公司;TDL-5C型低速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠;AKJY-20超純凈水機，艾柯;KQ-250DE型數控超聲波清洗機，昆山超聲儀器有限公司;PHS-3C型酸度計，上海虹儀儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃酮的提取

取100 g甘薯葉60°C烘至恒重，粉碎后過40目，準確稱取0.3 g干粉，溶于體積分數為60%的乙醇中，固液比 1∶20(g∶mL)，溫度 40°C，每次 20 min，提取3次，超聲波功率178.5 W，超聲提取前靜置5 min，提取液2 000 r/min離心3 min，合并提取液即為黃酮提取液。

1.2.2 兩種測定方法的波長掃描

1.2.2.1 AlCl3-KAC顯色法

AlCl3-KAC顯色法參考文獻［3］，并稍作改動。準確吸取提取液1 mL，依次加入0.1 mol/L AlCl32 mL、1 mol/L乙酸鉀3 mL，最終用甲醇溶液定容至10 mL，搖勻，室溫下放置30 min。在4 000/min速度下離心10 min，在200～1 000 nm區間內進行波長掃描，根據最大吸收峰確定測定波長。

1.2.2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法參照文獻［4］，并稍作改動。準確吸取提取液1 mL，依次加入2mL

去離子水、0.5 mL質量分數5%亞硝酸鈉混合，振蕩后靜止放置6 min，加入0.5 mL質量分數10%硝酸鋁，振蕩后靜置6 min，然后加入2.5 mL質量分數5%NaOH，振蕩后靜置15 min.最后用去離子水定容至9 mL，在200～1 000 nm區間內進行波長掃描，根據最大吸收峰確定測定波長。

1.2.3 兩種測定方法結果的比較

本研究采用2種空白對照的制作方法:方法(1):以蒸餾水為空白;方法(2):空白對照不添加顯色劑(AlCl3或Al(NO3)3)，其他試劑與樣品制作時添加的相同。將樣品的吸光度值減去空白對照的吸光度值獲得吸光度值，以最終獲得吸光度值。最后運用SPSS17.0對2種方法獲得的吸光度值進行統計分析，對比2種方法的優劣。

2 結果

2.1 兩種測定方法的波長掃描結果

通過對2種測定方法進行的波長掃描(見圖1)，AlCl3-KAC顯色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法最大吸收峰對應的波長分別為361、498 nm，故2種方法測定時選取的波長分別為360、500 nm。

圖1 兩種測定方法的波長掃描圖

2.2 兩種測定方法結果的比較

由圖2、圖3知，單從樣品的吸光度值測定曲線看，AlCl3-KAC顯色法穩定性明顯強于NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法。樣品的吸光度值減去空白對照的吸光度值獲得最終的測定結果，由圖4知，以蒸餾水為空白對照的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法在600 s內吸光度值的標準誤差、標準差、方差、峰度、偏度等指標上均優于其他曲線(見表1)，可見、甘薯葉總黃酮含量測定最適方法為以蒸餾水為空白對照的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法。

圖2 AlCl3-KAC顯色法吸光度值隨時間變化圖

圖3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法吸光度值隨時間變化圖

圖4 600 s內測量值變化曲線

表1 兩種測量方法吸光度值的統計分析

3 討論與結論

可見及紫外分光光度法是黃酮測量常用的方法，該方法有操作簡便、檢測成本低的優點，當前使用較多的可見及紫外分光光度法有NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法和 AlCl3-KAC顯色法 2種，而由于AlCl3-KAC顯色法獲得的黃酮含量的測量值比實際的要低，所以，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法的使用更為普遍，大約70%的已有報道使用該法。在已有報道中分光光度法空白對照的制作方法有2種:方法(1)以蒸餾水為空白;方法(2)空白對照不添加顯色劑［本研究為AlCl3或Al(NO3)3］，其他試劑與樣品制作時添加的相同。在這2種制作方法中，方法(1)是早期常用到的空白制作方法，而方法(2)排除了顯色劑以外試劑的影響，被認為是改進的和更好的空白對照制作方法，但在本研究中使用空白對照制作方法(1)的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法表現出更好的穩定性。另外、本研究對2種測量方法進行的波長掃描(200～1 000 nm)，確定了 AlCl3-KAC顯色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法最大吸收峰波長分別為:360、500 nm。故在500 nm處以蒸餾水為空白的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法是甘薯葉總黃酮含量測定的最適方法，該法可以為甘薯其他組織中總黃酮含量的測定提供參考。

［1］ 中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京:科學出版社，1979，64(1):88 －90.

［2］ 延璽，劉會青，鄒永青，等.黃酮類化合物生理活性及合成研究進展［J］.有機化學，2008，28(9):1 534 －1 544.

［3］ NY/T1295－2007.蕎麥及其制品中總黃酮含量的測定［S］.

［4］ 楊磊，賈佳，祖元剛.山楂屬果實提取物的體外抗氧化活性［J］.中國食品學報，2009，9(4):28－32.

Study on the Determination of Flavonoid in Sweet Potato Leaves

Li Guang1，3，Yu Shuang2，3，Deng Yin3，Chen Qin-fu3
1(Department of Chemistry and Biological Agronomy，Anshun University，Anshun，561000，China)2(Department of resource and environment，Anshun University，Anshun 561000，China);3(School of Life Science，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China)

Ultrasonic-assisted method was used to extract flavonoids from Sweet Potato leaves.By the wavelength scan，we found that the maximum absorption peak wavelength of AlCl3-KAC colorimetric method is 360 nm and the maximum absorption peak wavelength of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetric method is 500 nm.The two different blank controls by spectrophotomretry on final the results were compared.The best methods was selected based on standard error，standard deviation，variance，kurtosis and partial degree.The results show that NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetric method at the wavelength of 500 nm with distilled water as blank is the best way.This method is reproducible and convenient，and can be used to detect flavonoids contents in other parts of Sweet Potato.

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博士研究生，講師(陳慶富教授為通訊作者，E-mail:cqf1966@163.com)。

*貴州省農業攻關項目(黔科合NY字［2010］3014)

2011－08－22，改回日期:2011－11－07