干熱和濕熱工藝對大豆轉基因成分及調控元件影響的比較研究

王 林 韓 飛 李愛科 韓 偉 劉建學

干熱和濕熱工藝對大豆轉基因成分及調控元件影響的比較研究

王 林1，2韓 飛1李愛科1韓 偉1劉建學2

(國家糧食局科學研究院1，北京 100037)
(河南科技大學食品學院2，洛陽 471003)

以轉基因大豆為試驗材料，運用定性PCR的方法研究了干熱和濕熱兩種制粒加工工藝對轉基因大豆內源基因Lectin、外源基因Cp4 epsps以及啟動子和終止子的影響。結果發現大豆經過130℃干熱處理3 min或100℃濕熱處理15 min后，內源基因降解到407 bp以下;經過120℃加熱9 min或100℃濕熱處理15 min后，外源基因降解到408 bp以下;干熱處理對啟動子的片段長度并沒有影響，而當加工條件達到130℃干熱9 min時，終止子125 bp的片段開始會產生降解;當100℃、3 min濕熱處理后啟動子和終止子都會產生降解。結果表明，不同干熱和濕熱制粒工藝對大豆轉基因成分及調控元件的降解均有不同程度的影響。

加工工藝 基因 啟動子 終止子 PCR技術

隨著轉基因技術的飛速發展，近年來轉基因產品開發研究不斷深入，越來越多的轉基因農產品商品化，相應的轉基因農產品市場占有率也明顯增加。轉基因大豆及其制品日益增多，己經直接或間接地影響到人們的生活。也正因如此，轉基因大豆及其制品對人體健康及生態環境的影響引起人們的廣泛關注。大豆加工過程中DNA的量及降解程度都因其加工工藝不同而不同，全面了解大豆加工過程中內外源基因及調控元件的降解變化規律對規范大豆生產工藝、提高其相關產品的管理力度具有重要的現實意義。

本研究參考主要原料大豆轉基因品系和外源基因種類，以大豆凝集素基因(Lectin)為內標基因［1－2］，設計了不同引物來檢測其外源基因Cp4 epsps、啟動子CaMv35s和終止子Nos，從核酸定性分析水平上，利用PCR技術研究干熱和濕熱的制粒加工工藝對大豆中內外源基因、啟動子及終止子片段長度的影響，建立定性PCR檢測轉基因大豆的特異性檢測方法。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

轉基因大豆:河北三河匯福糧油有限公司;液氮:北京城信順興氣體原料銷售有限公司;苯酚:上海源景化學品有限公司;氯仿、乙醇(分析純):北京化工廠;TE緩沖液:上海索萊寶生物科技有限公司;Taq酶、DNA Marker:大連寶生物工程有限公司;Goldenview核酸染料:北京天恩澤基因科技有限公司;瓊脂糖:北京拜爾迪生物公司。

1．2 儀器與設備

PL403－IC電子天平:梅特勒－托利多儀器有限公司;DK－8D電熱恒溫水槽、DGG－9140AD電熱恒溫鼓風干燥箱:上海森信實驗儀器有限公司;溫育機(ThermoStat plus)、PCR 擴增儀(Mastercycler 5333)、離心機(5424)、混勻器(Thermomixer comfort):德國艾本德公司;DYY－8C電泳儀:北京六一化工廠。

1．3 試驗方法

1．3．1 引物的設計

針對Lectin基因設計了3對引物序列，擴增片段大小分別為 1 060 bp、836 bp、407 bp，針對 Cp4 epsps基因設計了3對引物序列，擴增片段大小分別為1 512 bp、408 bp、190 bp，針對啟動子 CaMV35 s和終止子各設計了一對引物序列，擴增片段大小分別為165 bp和125 bp。

1．3．2 樣品的制備與處理

大豆的干熱加工處理:取一定量的轉基因大豆粉，放入離心管中，設置8個溫度梯度，分別為60、70、80、90、100、110、120、130 ℃，進行干熱處理，處理時間分別為3、6、9 min。大豆的濕熱加工處理:將大豆置于高壓滅菌鍋內70、80、90、100 ℃各放置3、9、15 min。

1．3．3 大豆DNA的提取

稱取100 mg試樣在液氮中充分研磨成粉狀至1．5 mL離心管中，加入1 mL、65℃預熱的CTAB抽提緩沖液，充分均勻混合后置恒溫箱中65℃溫育30 min，其間充分顛倒混勻2～3次。12 000 r/min室溫下離心10 min，取上清液至新的離心管中，用等體積苯酚/氯仿溶液(1∶1)抽提，充分混勻。12 000 r/min離心10 min，取上清液后再用等體積的氯仿抽提一次。12 000 r/min離心10 min。轉移上清于0．6倍體積經－20℃預冷的異丙醇中，并在－20℃下靜置30 min，12 000 r/min離心20 min以沉淀 DNA。棄上清，加入1 mL－20℃預冷的70%乙醇清洗沉淀物，短時間離心后棄乙醇，重復洗滌過程一次。在吸水紙巾上風干，直至乙醇揮發殆盡。干燥后加入100μL TE緩沖液，－20℃保存備用。

1．3．4 PCR 的擴增

PCR反應體系:5μL PCR反應緩沖液，2 mmol Mg2+，1．25U Taq 酶，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各0．2 mmol/L，0．4 μmol/L 引物，一定量的模板 DNA，滅菌超純水補齊至50μL。

Lectin基因PCR反應條件:95℃預變性5 min，95 ℃變性 30 s，62．1 ℃ (60．8、58．1℃)退火 90 s(60、60 s)，72 ℃延伸90 s(60、60 s)，40 cycles，72 ℃延伸5 min。

Cp4 epsps基因 PCR反應條件:95℃預變性5 min，95 ℃變性 30 s，60．3 ℃(57、60 ℃)退火 90 s(60、60 s)，72 ℃ 延伸 90 s，40 cycles，72 ℃ 延伸5 min。

CaMv基因PCR反應條件:95℃預變性5 min，95 ℃變性 30 s，54．5 ℃ 退火 60 s，72 ℃ 延伸 90 s，40 cycles，72 ℃延伸 5 min。

Nos基因PCR反應條件:95℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，45．5 ℃ 退火 60 s，72 ℃ 延伸 90 s，40 cycles，72 ℃延伸 5 min。

1．3．5 PCR 產物檢測

引物 Lec3/Lec3．、引物 Cp2/Cp2．、引物 Cp3/Cp3．、引物 CaMv1/CaMv1．、引物 CaMv2/CaMv2．、引 物 CaMv3/CaMv3．、引 物 Nos1/Nos1．、Nos2/Nos2．在2．0%的瓊脂糖凝上 100 V恒壓，電泳35 min。

引物 Lec1/Lec1．、引物 Lec2/Lec2．、引物 Cp1/Cp1．、引物 EPSPS1/EPSPS1．、在 1．0% 瓊脂糖凝膠上100 V恒壓，電泳35 min。完畢后置凝膠成像儀中記錄結果。

2 結果與分析

2．1 干熱處理對大豆內源基因的影響

2．1．1 干熱處理對內源基因Lectin的影響

圖1至圖3所示為不同的干熱處理條件(溫度梯度分別為 60、70、80、90、100、110、120、130 ℃ 各進行干熱處理，處理時間分別為3、6、9 min)下，內源基因Lectin 1 060 bp、Lectin 836 bp和Lectin 407 bp片段的降解情況。

圖1 大豆經過干熱處理后Lectin 1 060 bp片段的PCR擴增電泳圖

由圖1a可以看出，在1～16的干熱條件下Lectin 1 060 bp片段沒有產生降解;而在17～24(圖1b)中，內源基因Lectin 1 060 bp片段已檢測不出。

圖2 大豆經過干熱處理后Lectin 836 bp片段的PCR擴增電泳圖

由圖2a可以看出，在1～18的干熱條件下Lectin 836 bp片段沒有產生降解;而在19～24(圖2b)中，內源基因Lectin 836 bp片段已檢測不出。

圖3 大豆經過干熱處理后Lectin 407 bp片段的PCR擴增電泳圖

由圖3a可以看出，在1～12的干熱條件下Lectin 407 bp片段沒有產生降解情況;而在22～24(圖3b)中，內源基因Lectin 407 bp片段已檢測不出。

圖1～圖3可知，從60℃一直加熱到100℃所測Lectin基因片段都未出現降解情況，但經過110℃，6 min處理后，1 060 bp片段開始被降解(圖1b)，不能再檢測到;當溫度升高到120℃，時間到達3 min時，836 bp的DNA片段不能被檢測到(圖2b);隨著時間的延長，當條件達到130℃，3 min時Lectin逐漸被降解到407 bp以下(圖3b)。

2．1．2 干熱處理對外源基因Cp4 epsps的影響

圖4至圖6所示為不同的干熱處理條件(溫度梯度分別為 60、70、80、90、100、110、120、130 ℃ 各進行干熱處理，處理時間分別為3、6、9 min)下，外源基因 Cp4 epsps 1 512 bp、Cp4 epsps 408 bp和 Cp4 epsps 190 bp片段的降解情況。

圖4 大豆經過干熱加工后Cp4 epsps1 512 bp片段的PCR擴增電泳圖

由圖4a可知，在1～12的干熱條件下Cp4 epsps 1 512 bp片段并未產生降解情況;而在13～24(圖4b)中，外源基因Cp4 epsps 1 512 bp片段已檢測不出。

圖5 大豆經過干熱處理后Cp4 epsps408 bp片段的PCR擴增電泳圖

由圖5a可知，在1～12干熱條件下Cp4 epsps 408 bp片段沒有產生降解的情況;而在21～24(圖5b)中，外源基因Cp4 epsps 408 bp片段已檢測不出。

圖6 大豆經過干熱處理后Cp4 epsps190 bp片段的PCR擴增電泳圖

由圖6可知，在1～24(60℃加熱3 min到130℃加熱9 min)的加工條件下外源基因Cp4 epsps 190 bp片段始終未產生降解的情況。

由圖4～圖6可知，在60～90℃所測大豆Cp4 epsps基因都未出現降解情況，但大豆經過100℃加熱3 min處理后1 512 bp片段就開始被降解了，不能再檢測到(圖4b);當溫度升高到120℃，9 min的時候，408 bp的DNA片段不能被檢測到(圖5b)，DNA逐漸被降解。

2．1．3 干熱處理對啟動子CaMv 35S與終止子Nos的影響

圖7和圖8所示為不同的干熱處理條件(溫度梯度分別為 60、70、80、90、100、110、120、130 ℃各進行干熱處理，處理時間分別為3、6、9 min)下，啟動子CaMv35S165 bp片段與終止子Nos 125 bp片段的降解情況。

圖7 大豆經過干熱處理后啟動子CaMv 35S165 bp片段的PCR擴增電泳圖

由圖7可以看出，在1～24(60℃加熱3 min到130℃加熱9 min)的加工過程中啟動子CaMv35S 165 bp片段都未產生降解。

圖8 大豆經過干熱處理后啟動子終止子Nos 125 bp片段的PCR擴增電泳圖

由圖8可知，當干熱條件達到24(130℃加熱9 min)時，終止子Nos 125 bp片段已檢測不出。

從圖 7～圖 8可以看出，在 60℃加熱3 min到130℃加熱9 min加工范圍內，干熱處理并未對啟動子產生很大的影響(圖7);而當加工條件達到130℃加熱9 min時，終止子125 bp的片段開始產生降解(圖8b)。

2．2 濕熱處理對大豆基因及調控元件的影響

2．2．1 濕熱處理對內源基因Lectin的影響

圖9表示的是濕熱處理對內源基因Lectin的影響PCR電泳擴增圖，濕熱處理即是將大豆置于蒸汽高壓鍋中，不同溫度各放置3、9、15 min，當條件達到70℃，3 min時1 060 bp的片段就不能檢測到了(圖9a)，1 060 bp的片段只能在大豆原料中存在;當條件達到100℃，9 min時Lectin的片段就降解到836 bp以下(圖9b);當條件到達100℃，15 min時Lectin片段降解到407 bp以下(圖9c)。

圖9 大豆經過濕熱處理后不同片段內源基因Lectin的PCR擴增電泳圖

2．2．2 濕熱處理對外源基因Cp4 epsps的影響

圖10為將大豆置于蒸汽高壓鍋中70、80、90、100℃，各放置3、9、15 min得到 Cp4 epsps基因不同片段的擴增結果圖，1 512 bp這樣大一些片段在處理90℃濕熱9 min已經不能檢測到了(圖10a);經過100℃濕熱15 min處理后408 bp的片段不能被檢測到(圖10b)，190 bp的小片段在所有處理后仍能檢測到(圖10c)。

圖10 大豆經過濕熱處理后外源基因Cp4 epsps的PCR擴增電泳圖

2．2．3 濕熱處理對啟動子CaMv35S與Nos終止子的影響

當加工條件達到100℃濕熱3 min時，啟動子CaMv35S165 bp片段就再也檢測不到了(圖11a)。當試驗條件達到100℃濕熱3 min時，終止子Nos 125 bp的片段已經降解(圖11b)，相比干熱處理，濕熱加工更能對啟動子和終止子產生降解。

圖11 大豆經過濕熱處理后啟動子CaMv35S與Nos終止子的PCR擴增電泳圖

3 討論與結論

目前市場上大多數的大豆為轉基因大豆，從理論上來說，轉基因產品經過若干的加工程序，例如物理、化學或者酶因子都會使DNA被破壞［3］。Gawienowski MC等［4］研究表明，經浸泡、濕磨等加工過程能使玉米基因和質粒DNA降解，135℃加熱2 h后，DNA幾乎完全降解。Rogan等［5］認為，浸泡后又經過物理破碎處理而做成的豆奶、豆腐和熱加工做成的玉米糊和馬鈴薯，沒有檢測出大于1．1 kb的DNA片段。Chiter等［6］對飼料中的一些植物性原料，如油菜籽、小麥粉、亞麻籽、大豆、新鮮的玉米粉和玉米粒、甜菜及甜菜漿中DNA的穩定性進行了研究。結果表明，對作物原料至少進行5 min不低于95℃的熱處理是降解DNA所必需的，但對作物葉片和種子采用如研磨、粉碎等物理方法處理不能有效地降解其DNA。陳穎等［7］研究了大豆在加工為豆腐、豆奶和豆粉過程中各項加工工藝對CaMv啟動子和Nos終止子調控元件的影響，發現調控元件在食品加工過程中的降解變化與其所處位置有較大關系，大豆基因組DNA序列片段受加工過程的影響較小，在3種豆制品的加工過程中均能測到，原料經過加工后片段大小降解至200 bp以下;Nos終止子受食品加工工藝影響較小，在被檢測的每個食品加工過程中均能檢測到。此次試驗的目的在于如何利用加工環節破壞轉基因成分，降低轉基因糧食的食用和使用安全風險，以轉基因大豆為原料對其內外源基因及調控元件進行擴增，發現大豆在經過干熱和濕熱的制粒工藝后，其內源基因Lectin、外源基因Cp4 epsps、啟動子CaMv、終止子Nos都會引起不同程度的降解。研究表明，大豆經過130℃干熱處理3 min或100℃濕熱處理15 min后，內源基因降解到407 bp以下;經過120℃加熱9 min或100℃濕熱處理15 min后，外源基因降解到408 bp以下;干熱處理對啟動子的片段長度并沒有影響，而當加工條件達到130℃干熱9 min時，終止子125 bp的片段開始會產生降解;當100℃，3 min濕熱處理后啟動子和終止子都會產生降解，不同干熱和濕熱制粒工藝對大豆轉基因成分及調控元件的降解均有不同程度的影響。值得提出的是加工后的食品中含有多種添加劑，與普通原料相比，成分更為復雜，加工工藝更為繁瑣，對其中基因的影響可能是多方面的［8－9］，因此對加工后產品中基因的降解變化還需要進行深入的研究［10］，以進一步明確外源基因以及調控元件造成的潛在風險。

［1］鄭文杰，劉火亙，劉偉等．轉基因大豆加工產品的定性PCR 檢測［J］．農業生物技術學報，2003，11(5):467－471

［2］朱元招，尹靖東，李德發等．抗草甘膦轉基因大豆PCR定量檢測研究［J］．中國農業大學學報，2005，10(3):5－29

［3］Hagen M．Detection of genetically modified soy(Roundup －Ready)in processed food products［J］．Berl Munch Tierarztl Wochenschr，2000，113(11 －12):454 －458

［4］Gawienowski MC，Eckhoff SR，Ping Y，et al．Fate of maize DNA during steeping wet milling and processing［J］．Cereal Chem，1999，76(3):371 －374

［5］Rogan GJ，Dudin YA，Lee TC，et al．Immunodiagnostic methods for detection of enolpyruvyl shikimate phosphate synthase in Roundup Ready or soybeans［J］．Food Control，1999，10:407－414

［6］Chiter A，Michael J，Forbes M，et al．DNA stability in plant tissues:implications for the possible transfer of genes from genetically modified food［J］．FEBSLetters，2000，481:164 －168

［7］陳穎，王媛，徐寶梁，等．Roundup Ready大豆外源基因在食品加工過程中的降解變化［J］．中國油料作物學報，2005，27(2):10 －14

［8］王媛．轉基因大豆內、外源基因在食品加工過程中變化規律的研究［D］．北京:中國農業大學，2005

［9］朱元招．抗草甘膦大豆轉基因PCR檢測及其飼用安全研究［D］．北京:中國農業大學，2004

［10］梁杉，梁寧，蔣繼志，等．轉基因豆粕調控元件在飼料加工中降解變化的初步研究［J］．華北農學報，2009，2:201－205．

Comparative Study on Degradation of Transgenic Ingredients and Non－target Gene Components of Generally Modified Soybean with Dry－heating and Sticky－heating Processing

Wang Lin1，2Han Fei1Li Aike1Liu Jianxue2Wang Yingyao1
(Academy of State Administration of Grain1，Beijing 100037)
(Institute of Food，Henan University of Science and Tech－nology2，Luoyang 471003)

Based on generally modified soybeans for materials，the qualitative research methods of PCR were adopted to study the effects to Lectin gene and exogenous gene of Cp4 epsps and promoter and terminator by dryheating and sticky－ heating processing．Researches showed that endogenous gene degraded below to 407bp through processing after 130℃ dry－heating for 3min or 100℃ sticky－heating for 15 min．Exogenous gene degraded below to 408bp after 120℃ dry－heating for 9 min or 100℃ sticky－heating for 15 min．The DNA fragment of 125bp terminator turned to degrade after 130 ℃ dry－heating for 9min，while it made no difference to promoter．Promoter and terminator turned to degrade after 100℃ sticky－heating for 3 min．The results also indicated that gene sections had all degraded to some extent by dry－heating and sticky－heating palletizing processing．

processing，gene，promoter，terminator，PCR Tech－nology

Q7

A

1003－0174(2011)10－0044－07

轉基因生物新品種培育重大專項(2009ZX08012－012B)

2010－10－22

王林，男，1985年出生，碩士，生物技術

韓飛，女，1973年出生，副研究員，博士，食品營養與安全