一種新型Hsp90抑制劑的合成及其抑制活性*1

張曉穎, 張 杰, 李 偉, 王小龍

(南京中醫藥大學 藥學院,江蘇 南京 210029)

熱休克蛋白(Hsp)是生物體中普遍存在的高度保守的蛋白質,根據分子量大小可分為五大類:Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60和小Hsp。其中Hsp90和Hsp70與信號分子的關系尤其密切,在細胞惡性轉化和轉移過程中發揮重要作用[1]。Hsp90是胞質蛋白,在哺乳動物細胞中包括：胞質伴侶(Hsp90α,可誘導型/主要型; Hsp90β,組成型/次要型)，同功異質體內質網伴侶GRP94(葡萄糖相關蛋白94),線粒體同族體Hsp75/TRAP1(腫瘤壞死因子受體相關蛋白1)[2]。Hsp90α在腫瘤細胞中的高表達是許多腫瘤細胞生存的重要條件，因此抑制Hsp90α活性已經成為抗腫瘤的重要靶點[2]。研究表明,許多原癌蛋白都是Hsp90的作用蛋白,如:酪氨酸激酶、絲氨酸/半胱氨酸激酶、缺血誘導因子、端粒酶、突變p53等,這些蛋白酶功能的實現直接依賴于Hsp90的分子伴侶作用。對腫瘤細胞內的Hsp90分子伴侶作用進行抑制,可以間接地同時阻斷多種原癌信號通路,從而抑制癌細胞生長、促使癌細胞凋亡。因此,Hsp90已經成為日益引人關注的新型抗癌藥物研究的重要作用靶標[3]。

吡唑類化合物是近期報道的一類活性較高的Hsp90抑制劑，基于SNX-2112對HSp90的親和力與結合方式已有實驗確證[4]。本文設計了一條制備Hsp90抑制劑的新合成路線:對氨基苯甲酸在冰浴冷卻下生成重氮鹽，調節至pH 5后與2-氯乙酰乙酸乙酯反應制得(Z)-4-[2-(1-氯-2-乙氧基-2-羰亞甲基)肼基]苯甲酸(1); 1與二甲基環己二酮成環制得4-[1-(6,6-二甲基-4-氧-3-乙酰氧基-4,5,6,7-四氫吲唑)]苯甲酸(2); 2與對羥基環己胺完成酰胺化反應合成了一種新型Hsp90抑制劑——N-(4-羥基環己基)-4-[1-(6,6-二甲基-4-氧-3-乙酰氧基-4,5,6,7-四氫吲唑)]苯甲酰胺(3, Scheme 1),其結構經1H NMR表征。熒光偏振法研究結果表明3對Hsp90α具有明顯的抑制活性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

3F-20D型暗箱式紫外分析儀;Bruker Avance Ⅲ 400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；Mariner 5140型電噴霧質譜儀;Biotech型酶標儀。

柱色譜用硅膠(100目～200目，300目～400目),青島海洋化工廠;GF254薄層層析硅膠板,煙臺德信生物科技有限公司;其余所用試劑均為分析純,乙醇經鎂和碘作無水處理。BPS(分析緩沖液，Hsp90α酶試劑,Cat.No.50298), DTT(二硫蘇糖醇,40 mmol·L-1), BSA(牛血清白蛋白,2 mg·mL-1)和二甲亞砜(DMSO),百靈威。1.2 合成

(1) 1的合成

在三頸燒瓶中依次加入水70 mL，無水乙醇10 mL,對氨基苯甲酸2.74 g(20 mmol)和濃鹽酸6 mL，攪拌至完全溶解(溶液澄清透明)，置低溫恒溫反應浴(0 ℃～5 ℃)中,攪拌下分批加入亞硝酸鈉1.4 g(20 mmol),加畢，反應30 min(淡黃色澄清透明液體)。用無水乙酸鈉調節至pH 5，攪拌下緩慢滴加2-氯乙酰乙酸乙酯2.69 g(20 mmol)的乙醇(20 mL)溶液，滴畢，劇烈攪拌下反應24 h(淡黃色固體)。減壓抽濾，濾餅真空干燥后用無水乙醇重結晶得淡黃色針狀結晶1 4.21 g，收率77.7%;1H NMRδ: 12.64(s, 1H, CO2H), 10.82(s, 1H, NH), 7.89(d,J=8.7 Hz, 2H, ArH), 7.41(d,J=8.8 Hz, 2H, ArH), 4.29(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 1.29(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3); MS (m+H)/z(%): 271.05(100), 273.04(32), 272.05(11.9)。

(2)2的合成

在三頸燒瓶中依次加入乙醇鈉0.68 g(10 mmol)的乙醇(50 mL)溶液,1,3-二甲基環己二酮1.4 g(10 mmol),攪拌使其完全溶解，于室溫反應7 h；加入1 2.71 g (10 mmol),于室溫反應1 h;于90 ℃反應過夜。用10%鹽酸調至pH 7,分液，水層用乙酸乙酯萃取至無色；合并萃取液，濃縮后經硅膠柱層析[梯度洗脫劑:V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=3 ∶1～1 ∶1]分離，用丙酮重結晶得黃色針狀結晶24.5 g，收率20%;1H NMRδ: 8.14(d,J=8.4 Hz, 2H, ArH), 7.76(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 4.34(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 2.99(s, 2H, CH2), 2.42(s, 2H, CH2), 1.32(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3), 1.04(s, 6H, CH3); MS (m+H)/z(%): 357.17(100), 358.18(20.5)。

(3)3的合成

在反應瓶中加入270 mg,用適量DMF溶解后加入三乙胺50 mg(6 eq),攪拌10 min;加入HBTU(苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽)380 mg(5 eq),攪拌20 min;再加268 mg，于45 ℃反應24 h。濃縮后經硅膠柱色譜層析[洗脫劑:V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶2]分離，用丙酮重結晶得白色或微黃色粉末3,收率70%;1H NMR(CDCl3)δ: 7.92(d,J=8.6 Hz, 2H, ArH), 7.60(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH)), 6.07(d,J=7.8 Hz, 1H, NH), 4.49(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 3.99～4.02(m, 1H, CH), 3.85～3.56(m, 1H, CH), 2.83(s, 2H, CH2), 2.50(s, 2H, CH2), 2.12(dd,J=38.9, 11.4 Hz, 4H, CH2), 1.46(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3), 1.32～1.56(m, 4H, CH2), 1.12(s, 6H, CH3)。

1.3 3對Hsp90α的親合力測定[5]

用熒光偏振法測定3對Hsp90α的親合力。當熒光素與蛋白結合時相對分子質量變大，旋轉速度就會減慢，于是在特定時間內向同一方向發出發射光，熒光偏振值較大。

配制20 mmol·L-13的DMSO溶液(儲存液)，用DMSO稀釋至c(3)分別為125 μmol·L-1, 25 μmol·L-1, 5 μmol·L-1, 1 μmol·L-1, 0.2 μmol·L-1, 0.04 μmol·L-1, 0.008 μmol·L-1, 0.0016 μmol·L-1。

表 1 反應液組成(以每孔計算)Table 1 Composition of the reaction solution

ac(3)=100 nmol·L-1

各c(3)溶液5 μL加入384孔空白板中，每個c(3)兩個重復孔;另加10%DMSO 5 μL作空白對照。在有試液的各孔中加入預先配制的反應液(組成見表1) 45 μL。于室溫孵育2 h。在酶標儀上讀取數據，記錄熒光偏振值(FP)。

2 結果與討論

采用SPSS 17.0統計分析軟件計算3的IC50為657.257(經典HSp90抑制劑geldanamycin的IC50為65.24[5])。c(3)對于熒光偏振值的影響見圖1。由圖1可見，隨著c(3)的降低，熒光偏振值逐漸增高，說明3對Hsp90α有明顯的親和力。Hsp90抑制劑的作用機制是與Hsp90N端的ATP活性中心相結合，從而產生抑制作用。3與Hsp90α的親和力越高，提示其對該酶的抑制活性越好。

c(3)/×10-9 mol·L-1圖 1 c(3)對于熒光偏振值(FP)的影響Figure 1 Effect of c(3) on fluorescence polarization value(FP)

[1] Pratt W B, Toft D O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery[J].Exp Biol Med,2003,228:111-133.

[2] 王緋,楊永平. HSP90抑制劑靶向治療癌癥研究進展[J].解放軍醫學雜志,2006,3(31):274-275.

[3] 李永強,袁霞,周玉美. 熱休克蛋白90(Hsp90)抑制劑熒光標記探針化合物的設計合成[J].中國藥物化學雜志,2009,6(19):170-180.

[4] Kenneth H Huang, James M, Veal R,etal. Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat shock protein 90 as potent,selective and orally active antitumor agents[J].J Med Chem,2009,52:4288-4305.

[5] 董飚,陶佩珍,李艷萍. 熒光偏振法建立格爾德霉素-Hsp90α結合高通量篩選模型及其應用[J].中國新藥雜志,2011,20(5):447-450.