蜜蜂巢脾抗氧化活性與抗菌活性的研究

褚亞芳，胡福良

浙江大學動物科學學院，杭州310029

蜜蜂巢脾抗氧化活性與抗菌活性的研究

褚亞芳，胡福良*

浙江大學動物科學學院，杭州310029

以意蜂巢脾和中蜂巢脾為研究材料，分別采用水提法和醇提法處理，對獲得的4種提取物，以DPPH·法測定自由基清除能力，福林酚法測定總酚含量，瓊脂擴散法測定其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌半徑。結果表明，巢脾提取物具有一定的抗氧化活性和抑菌活性，且含有豐富的酚類化合物。除了對大腸桿菌的抑制作用外，巢脾水提液效果優于巢脾醇提液;除DPPH·清除能力外，意蜂巢脾效果優于中蜂巢脾效果;生物學活性呈現濃度依賴效應。本研究為巢脾在中醫藥領域的應用提供了一定的解釋，并證明了巢脾是一種潛在的天然生物資源。

中蜂巢脾;意蜂巢脾;DPPH·;總酚含量;抑菌活性

巢脾，是指由蜜蜂筑造的雙面布滿巢房的脾狀蠟質結構，是蜜蜂棲息、繁衍育子、貯存釀造食物的場所［1］。由于繭衣的堆積以及蜂產品儲存后的殘留，隨著培育蜜蜂世代的增加，巢房的顏色由白色或者淡黃色轉為褐色甚至黑色，巢脾的成分也變得相當復雜。

巢脾是一種中國民間傳統藥物，用于治療或者輔助治療鼻炎、肝炎、支氣管炎、風濕性關節炎、牙周炎、皮膚病等，但是目前對巢脾整體的生物學活性和藥理藥效研究卻十分匱乏。一些研究者認為蜜蜂巢脾與有著悠久藥用歷史的中藥蜂房(也稱為露蜂房)功效相似。蜂房(Nidus vespae)為胡蜂科昆蟲果馬蜂、日本長腳胡蜂仔或異腹胡蜂的巢［2］，在抗齲齒、調節機體免疫力和抗腫瘤方面均有一定功效［3-5］。本實驗通過研究中華蜜蜂(Apis cerana cerana)巢脾和意大利蜜蜂(A.mellifera ligustica)巢脾的水提液和醇提液的抗菌、抗氧化活性，以及總酚含量的測定，一方面探究不同品種蜜蜂巢脾生物學活性的差異，以及不同提取溶劑對巢脾生物學活性的影響;另一方面，為巢脾的藥理研究提供理論基礎，為巢脾的進一步開發利用提供實驗根據。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

意蜂巢脾(使用一年以上):由杭州蜂之語蜂業股份有限公司有機蜂場提供;

中蜂巢脾(使用一年以上):由浙江省金華市大地養蜂專業合作社提供;

菌種:金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，由浙江省中醫藥研究院提供;

2，2-二苯基-1-苦肼基自由基(DPPH，SIGMA); Folin-Ciocalteu試劑和氯霉素(生物工程(上海)有限公司);2，6-二叔丁基對甲酚(BHT，SUPELCO);抗壞血酸、蛋白胨、牛肉浸出膏和瓊脂粉(國藥集團化學試劑有限公司);沒食子酸(BIO BASIC INC.)。

1.2 主要儀器

UV-2550型光譜儀(日本島津公司);KQ-500E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);GZX-9246MBE型數顯鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠);TB-215D型電子分析天平(DENVER INSTRUMENT);游標卡尺(廣陸數字測控股份有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 巢脾提取液的制備

巢脾→–18℃冷凍→粉碎→過20目篩→水提1 h(固液比1∶6(w∶v);98℃水浴)/95%乙醇提取24 h(固液比1∶6(w∶v);每2 h超聲波清洗儀處理10 min，共5次)→過濾→除蠟→濃縮至生藥量為500 mg/mL→–18℃保存

濾渣重新提取多次，獲得4個樣品，分別為:意蜂巢脾水提液(Mw);中蜂巢脾水提液(Cw);意蜂巢脾醇提液(Me);中蜂巢脾醇提液(Ce)。

1.3.2 巢脾提取物清除DPPH自由基的能力

取2 mL DPPH乙醇溶液(125 μM)與1.6 mL的95%乙醇混合，加入400 μL巢脾提取液，混合均勻，室溫避光精確反應60 min之后，在517 nm波長下測吸光值。以抗壞血酸和BHT作為參照，實驗重復3次。樣品對DPPH自由基清除能力以EC50表示，即清除50%DPPH自由基所需要的抗氧化劑濃度，通過繪制抑制率－提取物濃度曲線得到［6］。

抑制率的計算公式如下:

式中:Ai=2.0 mL DPPH溶液+1.6 mL 95%乙醇+0.4 mL待測溶液的吸光度值

Aj=0.4 mL待測溶液+3.6 mL 95%乙醇的吸光度值

Ac=2.0 mL DPPH溶液+2.0 mL 95%乙醇的吸光度值

1.3.3 巢脾提取物總酚含量的測定

參照GB/T 8313-2008［7］，并略作修改。分別取空白對照溶液及樣品［4 mg/mL(生藥量)］各400 μL于試管內，加入2.0 mL 10%Folin-Ciocalteu試劑，混勻。5 min后，加入1.6 mL 7.5%Na2CO3溶液，混勻，室溫避光反應60 min。在765 nm波長下測吸光值。以樣品的溶劑作為空白對照。

標準曲線制作:按上述方法分別測定10、20、30、40、50 μg/mL濃度沒食子酸的吸光值。根據沒食子酸工作液的濃度和對應吸光值，制作標準曲線，得到方程為y=11.63143x+0.00438，R2=0.999 (x為沒食子酸濃度，y為吸光值)。

根據樣品對應的吸光值，由標準曲線查出或者回歸方程計算樣品中相當于沒食子酸的總酚含量，并進一步換算成巢脾生藥中總酚含量。

1.3.4 巢脾提取物的抗菌活性

以濾紙片擴散法研究4種巢脾提取液不同濃度下對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用。其中Mw和Cw，在使用前以0.22 μm無菌有機濾膜過濾除菌。選擇溶劑作為陰性對照，氯霉素和蜂膠醇提液(EEP)作為陽性對照。

取100 μL菌液(1～2×107個/mL)均勻涂布于營養瓊脂培養基(約厚4 mm)表面。取不同濃度的各種提取物、對照樣品各10 μL轉移至無菌干燥濾紙片(直徑7 mm)，晾干，用鑷子夾取濾紙片貼于平板表面［8］。37℃恒溫培養24 h，測量濾紙片周圍抑菌圈直徑大小。

2 結果和討論

2.1 巢脾提取物清除DPPH自由基的能力

巢脾對DPPH自由基的清除能力以清除率－K表示，K值越大則說明抗氧化能力越強。從圖1和圖2可見，巢脾對DPPH的清除能力呈現濃度依賴性。巢脾提取液的抗自由基活性采用EC50值表示，EC50值越小，則抗自由基活性越強。EC50值從低到高依次為Vc、BHT、Cw、Mw、Me和Ce，具體見圖3。中蜂巢脾水提液效果高于意蜂巢脾水提液，而中蜂巢脾醇提液效果低于意蜂巢脾醇提液。意蜂具有采膠的習性，巢脾中含有一定量的蜂膠，而中蜂不產蜂膠;蜂膠有效成分易溶于乙醇。這可能是意蜂巢脾醇提液抗氧化效果優于中蜂巢脾醇提液的一個重要因素。以此推測巢脾水提液中的主要抗氧化物質來源不是蜂膠。

2.2 巢脾提取物總酚含量的測定

巢脾提取液中總酚含量以沒食子酸當量(GAE)表示，即表述為mg GAE/g巢脾生藥。具體結果見表1:

表1 巢脾提取液的總酚含量(±s，n=3)Table 1 Total phenolic contents of extracts of honeycomb(x± s，n=3)

表1 巢脾提取液的總酚含量(±s，n=3)Table 1 Total phenolic contents of extracts of honeycomb(x± s，n=3)

Sample Mw Cw Me Ce總酚含量Total phenolic contents (mg GAE/g honeycomb)樣品11.43± 0.78 9.48± 0.14 6.33± 0.05 7.26± 0.04

總酚含量可用于衡量樣品的還原能力，蜂蜜和蜂膠等得總酚含量與抗氧化能力之間具有良好的線性關系［9，10］;對于其他一些樣品如萵苣則不然［11］。本實驗所建立巢脾的總酚含量與其抗氧化活性線性相關模型顯示，兩者的相關性較低(R2=0.5228)。推測其原因，可能是中蜂巢脾和意蜂巢脾的抗氧化成分存在差異，不同的抗氧化成分往往具有不同強度的自由基清除活性。另外，不同的酚類化合物與福林酚的反應程度不一，分子式相同的酚類化合物也會因為分子結構的不同而具有不同的抗氧化活性［12］。巢脾還可能存在酚類之外的重要抗氧化物質。

2.3 巢脾提取物抗菌活性的測定

2.3.1 巢脾提取物對大腸桿菌的抑菌作用

巢脾提取物對大腸桿菌的抑制作用較弱，抑菌圈小而且邊緣不清晰。其中Me對大腸桿菌的抑制作用相對較強，Mw和Ce的效果同EEP相似，Cw效果最差。具體結果見表2。陽性對照氯霉素對大腸桿菌顯示出強效作用，對其建立的半對數線性模型中，抑菌圈直徑和作用濃度具有極好的相關性(R2=0.9927)。蜂膠對革蘭氏陽性細菌的抑制作用優于其對革蘭氏陰性細菌的抑制作用［13，14］，大腸桿菌是典型的革蘭氏陰性細菌，蜂膠對大腸桿菌的抑制作用不明顯。溶劑對照組無抑菌圈形成，說明溶劑對本實驗結果無影響。

2.3.2 巢脾提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

巢脾提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性較高，并呈現濃度依賴效應。高濃度的巢脾水提液具有比較清晰的抑菌圈邊緣，濃度低的樣品以及巢脾醇提液抑菌圈小且邊緣模糊，或者無明顯抑菌圈形成。其中，Mw對金黃色葡萄球菌的抑制作用最明顯，其濃度為500 mg/mL(生藥量)樣品的抑菌圈甚至略大于50 mg/mL EEP的抑菌圈。Me對金黃色葡萄球菌的抑制作用最弱，僅最高濃度樣品有可見抑菌圈形成。巢脾提取物對金黃色葡萄球菌的抑制活性從高到底依次為:Mw＞Cw＞Ce＞Me。氯霉素對金黃色葡萄球菌具有強效作用，蜂膠的抑制活性也較強，對其建立的半對數線性模型中，抑菌圈直徑和作用濃度具有良好的相關性(R2=0.9782和R2=0.9958)。

3 結論

巢脾提取物具有一定的抗氧化活性和抑菌活性，總體上呈現濃度依賴效應，且含有豐富的酚類化合物。Mw總酚含量最高(11.43±0.78 mg GAE/g巢脾)，最高濃度Mw對金黃色葡萄球菌所形成的抑菌圈相對最大(11.87±0.97 mm)，其DPPH自由基清除能力(EC50=0.427 mg/mL)僅次于Cw(EC50= 0.37 mg/mL)，對大腸桿菌的作用則極弱。

除了對大腸桿菌的抑制作用外，巢脾水提液效果優于巢脾醇提液。由此推斷陳年巢脾作為藥用時采用水提法更為合適，與傳統中醫藥常使用水煎法處理巢脾和露蜂房以獲得有效藥用成分相一致。在水提液中，除DPPH自由基清除能力外，意蜂巢脾效果優于中蜂巢脾。龔蜜等研究發現意蜂老巢脾水提液和中蜂老巢脾水提液均能有效抑制金黃色葡萄球菌的生長，前者的抑制作用顯著優于后者［15］。此外，巢脾提取液對金黃色葡萄球菌的作用效果略強于對大腸桿菌的作用，吳國棟等也報道了相似結果［16］。

表2 巢脾提取物抑菌半徑(±s，n=3)Table 2 Inhibition zones of extracts of honeycomb(±s，n=3)

表2 巢脾提取物抑菌半徑(±s，n=3)Table 2 Inhibition zones of extracts of honeycomb(±s，n=3)

注:E.C.:大腸桿菌;S.A.:金黃色葡萄球菌Note:E.C.:Escherichia coli;S.A.:Staphylococcus aureus

樣品Sample細菌Bacteria不同濃度下的抑菌半徑(mm) Zone of inhibition in diameter(mm) 500.00 250.00 125.00 62.50 31.25 15.63 E.C. 8.11±0.03 7.88±0.05 8.39±0.08 7.89±0.77 － －S.A. 11.87±0.97 10.18±2.46 8.02±0.65 － － －Cw(mg/mL) 500.00 250.00 125.00 62.50 31.25 15.63 E.C. 7.63±0.06 7.95±0.88 8.35±1.21 7.95±0.87 7.79±0.68 －S.A. 10.86±0.59 9.08±2.19 7.75±0.65 7.40±0.37 － －Me(mg/mL) 500.00 250.00 125.00 62.50 31.25 15.63 E.C. 9.73±0.79 9.08±0.36 8.97±1.44 8.62±0.90 8.29±0.62 －S.A. 7.92±0.39 － － － － －Ce(mg/mL) 500.00 250.00 125.00 62.50 31.25 15.63 E.C. 8.24±0.57 7.79±0.80 7.83±0.79 8.02±1.02 － －S.A. 8.16±0.09 7.53±0.21 7.28±0.49 7.38±0.34 7.45±0.44 －氯霉素(mg/mL) 3.00 1.50 0.75 0.38 0.19 0.09 E.C. 29.95±0.29 25.44±1.40 22.89±2.35 19.28±0.48 16.23±1.87 11.32±1.51 S.A. 27.12±0.25 23.53±1.19 20.31±0.13 16.08±0.35 14.26±1.24 12.50±0.66 EEP(mg/mL) 50.00 25.00 12.50 6.25 3.13 1.56 E.C. 8.30±0.94 8.14±0.07 8.06±0.12 7.86±0.06 7.59±0.30 7.51±0.44 S.A. 11.72±0.03 10.82±0.49 9.90±0.57 8.62±0.34 7.64±0.07 －Negative 95%乙醇Ethanol E.C. －Mw(mg/mL) S.A. －

我國是世界第一養蜂大國，巢脾資源十分豐富，研究和開發前景十分廣闊。

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Antioxidant and Antimicrobial Activities of Honeycomb

CHU Ya-fang，HU Fu-liang*
College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China

Water extracts and ethanol extracts were prepared from Apis cerana cerana honeycomb and A.mellifera ligustica honeycomb，both of which were used more than one year.The antioxidant activities of the 4 different type extracts were evaluated using the 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical(DPPH·)assay，while the total phenolic contents of these samples were measured by the Folin-Ciocalteu reagent method，respectively.Furthermore，the antimicrobial capabilities of the extracts were measured by the paper disc-agar diffusion method against Staphylococcus aureus and Escherichia coli.The results showed that all the 4 types of extracts of honeycomb were capable of scavenging free radicals and inhibiting both Staphylococcus aureus and Escherichia coli to some extent and rich in phenolic.Totally speaking，the water extracts perform better than the ethanol extracts in all except the antimicrobial ability againt Escherichia coli.Second，with the exception of the DPPH·scavenging acticity，the A.mellifera ligustica honeycomb over-performs the A.cerana cerana honeycomb.The bioactivities of the extracts of honeycomb show in a concentration-dependent manner.The results partly explained and supported the use of honeycomb in traditional Chinese medicine.Moreover，honeycomb could be potential sources of natural antioxidants and antimicrobial drug.

Apis cerana cerana honeycomb;A.mellifera ligustica honeycomb;DPPH·;total phenolic contents;antimicrobial ability

1001-6880(2011)04-0726-05

2010-01-20 接受日期:2010-05-20

國家蜂產業技術體系建設專項資金資助項目(NYCYTX-43)

*通訊作者 Tel:86-571-86971952;E-mail:flhu@zju.edu.cn

S896.9

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