姜黃素類似物的合成及體外抗氧化活性研究

陳莉敏，康建軍，劉 洋，林友文

福建醫科大學藥學院，福州350004

姜黃素類似物的合成及體外抗氧化活性研究

陳莉敏，康建軍，劉 洋，林友文*

福建醫科大學藥學院，福州350004

利用不同的芳香醛和乙酰丙酮縮合反應，合成了4種姜黃素類似物(A1～A4)，化合物的結構經IR、1H NMR及MS等測試技術表征確證。采用鄰苯三酚法研究化合物的體外抗氧化活性，臺盼藍細胞計數法研究體外抗腫瘤活性。結果表明，化合物A1、A2、A3的抗氧化活性和對K562細胞增殖的抑制活性均高于姜黃素，其活性與酚羥基密切相關。

姜黃素;類似物;合成;抗氧化活性;抗腫瘤活性

姜黃素(Curcumin，1，7-二(4-羥基-5-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮，見Scheme 1)是中藥姜黃的主要成分，是一種天然的酚類食品添加劑。1985年印度Kuttan首次發現姜黃素具有抗腫瘤活性［1］，近年的研究發現其還具有廣泛的生物活性如抗氧化、降血脂、抗菌以及抑制HIV-1整合酶活性［2］。姜黃素抗腫瘤作用包括對多種腫瘤細胞的體外生長抑制和誘導凋亡能力，體外抑制血管內皮細胞增殖和體內抑制毛細血管生成和增長［3］，而且具有分子量低、毒性小等特點。但由于其在水中溶解度小，穩定性差，生物利用度低等限制了應用［4］。目前，以新型天然植物活性成分為先導物進行結構優化和改造，是新藥研發的重要途徑之一，其中姜黃素類似物的研究引起廣泛的重視。

從姜黃素母核結構分析，兩個取代芳環通過1，6-庚二烯-3，5-二酮的連接橋鏈B部分把A、C兩個取代芳環相連接(見Scheme 1)，并認為A、C兩個不同基團取代的芳環可能為發揮抗腫瘤作用的關鍵結構單元［5］。本文對芳環取代基進行改造，通過1，7-位芳香環上取代基位置和種類的變化，在催化劑作用下，利用芳香醛和乙酰丙酮的縮合反應合成了一系列姜黃素類似物(見Scheme 2)，研究了它們的體外抗氧化和抗腫瘤活性，并探討A、C兩個芳環上取代基對活性的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

AVATR 330 FT-IR紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司)，KBr壓片;1100型高效液相色譜-離子阱質譜聯用儀(LC/MSD Trap)(美國Agilent公司); UNITY 500型超導核磁共振波譜儀(美國，Varian公司)，TMS為內標，CDCl3為溶劑;島津2450型紫外可見分光光度計;WRS-1B數字熔點儀(上海精密科學儀器有限公司)，溫度計未校正;臺盼藍(SIGMA公司);姜黃素、芳香醛及其他試劑均為分析純。

1.2 姜黃素類似物的合成

以四種不同的芳醛為原料，與乙酰丙酮在正丁胺作用下合成四種姜黃素類似物，合成方法如下:在裝有滴液漏斗的三頸瓶中先后加入0.1 mol芳香醛，0.05 mol乙酰丙酮，0.05 mol B2O3粉末，5 mL硼酸三正丁酯，80℃恒溫水浴，充分攪拌溶解，邊攪拌邊滴加1.5 mL正丁胺，于15 min內滴完，繼續攪拌反應2 h，將體系傾入150 mL熱的HAC中，攪拌2 h后，冰箱靜置冷藏，經不同方法分離純化得到目標物A1～A4。

A1［1，7-二-(2-羥基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分離純化:冰箱靜置分層，收集下層橙紅色油狀物，濃縮至膠狀透明，用乙醇重結晶，得到橙紅色晶體，收率85.4%。

A2［1，7-二-(4-羥基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分離純化:冰箱靜置，抽濾水洗析出固體，用乙腈∶水=3∶1重結晶，得褐色結晶性粉末，收率78%。

A3［1，7-二-(3，4-二羥基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分離純化同A2，得淺褐色結晶性粉末，收率84%。

A4［1，7-二-(2-吡啶基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分離純化:反應液濃縮，得黑色粘稠物，加少量氯仿溶解后，經硅膠柱層析分離，以氯仿∶甲醇按4∶1，7∶3和6∶4梯度洗脫，得褐色固體，收率75.2%。

1.3 姜黃素及姜黃素類似物對O-·2的清除率測定

在堿性條件下，鄰苯三酚法非常容易發生自氧化，同時伴隨著O-·2的生成。本文參照文獻［6］的實驗方法，利用姜黃素類似物對鄰苯三酚法自氧化的抑制來間接評價它們對O-·2的清除。1.3.1 移取5.00 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，加入4.70 mL去離子水，混勻后在25℃水浴中溫育20 min。取出后立即加入在25℃預熱過的0.30 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚，迅速搖勻后倒入比色杯，320 nm下每隔30 s測定吸光度值α (以5.00 mL Tris-HCl緩沖液和5.00 mL去離子水的混合液為對照)，以吸光度(α)對時間(t)作圖，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率ν0。

1.3.2 平行取5.00 mL pH8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液5份，分別加入4.2，3.7，3.2，2.7，2.2 mL的去離子水，再分別加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 0.5 mmol/L甲醇溶液的樣品，最后均加入0.3 mL鄰苯三酚使各份總體積保持在10mL，按上述ν0測定方法測得姜黃素及黃素類似物在不同濃度下的鄰苯三酚自氧化速率νC，按照公式η=(1－νC/ν0) ×100%計算求得到各樣品濃度下的清除率η。

1.4 姜黃素類化合物的抗腫瘤活性研究

體外實驗測定了姜黃素類似物對慢性粒細胞性白血病K562細胞增殖的抑制作用，篩選模型為臺盼藍細胞計數法。在96孔培養板上，接種K562細胞，接種量約5×104個/孔，每孔200 μL，本次實驗組設6組，分別加入不同濃度的藥物，使之終濃度分別為:2.5、5、10、20、40、80 ug/mL。對照組不加藥，每組設三個平行孔，37℃培養至48 h，取0.4%臺盼藍液與細胞懸液各50 μL混勻后，再取適量混合液充于細胞計數板上，計數4個大格的未染色的活細胞數。

細胞生長抑制率=(對照組細胞數－實驗組細胞數)/對照組細胞數×100%

以同一藥物的不同濃度的對數值對腫瘤細胞生長抑制率作圖，可得到劑量反應曲線，根據線性回歸方程求出該藥物的半數抑制濃度IC50，即細胞存活率減少50%時的藥物濃度。

2 結果與討論

2.1 關于姜黃素類似物的合成反應

經典的查爾酮衍生物的合成方法是以取代苯乙酮與取代苯甲醛在堿性醇溶液中縮合得到，文獻報道［7］苯甲醛或苯乙酮上的羥基對縮合反應收率的影響很大，當環上有兩個或兩個羥基以上時，反應幾乎不能進行。所以，羥基查爾酮不能用經典的方法合成。也有用羥基保護的方法合成羥基查爾酮，但使用此法結果先保護后縮合時，反應還需要脫保護，操作繁瑣，副產物多，難以分離。

本研究是利用不同的芳香醛和乙酰丙酮在硼酸和硼酸三正丁酯作用下反應合成姜黃素類似物，由于乙酰丙酮的3-亞甲基酸性比甲基強，在有機堿的作用下會優先失去質子氫發生反應，產生較多的副產物。故在制備中先將乙酰丙酮3-亞甲基與硼酸形成配合物進行保護，避免3-亞甲基優先反應，然后再與芳香醛進行縮合，采用此法副產物少，分離簡便，收率較高。

2.2 姜黃素類似物的理化性質及其結構的波譜表征

所合成的化合物經過了IR、1H NMR和MS等光譜的表征確證，波譜數據及產率、理化性質見表1。

表1 目標化合物的熔點及IR、1H NMR和MS數據Table 1 Melting point，IR，1H NMR and MS data of the target compounds

IR數據顯示，A1～A3在3300 cm–1左右均出現羥基吸收峰，而A3由于3位和4位羥基可形成分子內氫鍵，所以在3328.08 cm–1處出現一寬而強的峰;結構中的β-二酮由于與之相連的烷基體積較大，且含有芳環，故ν(C=O)吸收頻率降低，在1600 cm–1～1654 cm–1間出峰。1H NMR數據顯示，芳環上羥基取代數量及位置的不同，影響芳核上氫的化學位移，A3由于芳環上有兩個羥基取代，所以化學位移值在A1～A3中處于最低;β-二酮結構中的亞甲基上的H因為兩個羰基的吸電子作用，化學位移值明顯增大。

2.3 姜黃素類似物的體外抗氧化活性

目標化合物對O-·2的清除率的結果見表2。

表2 目標化合物和姜黃素對O-·2的清除率Table 2 Clearance rate of target compounds and curcumin on superoxide radicals

由表2數據可以看出，A1、A2、A3、A4均具有較好的清除O-·2的作用，并且清除作用隨樣品濃度增大呈現遞增趨勢，其中A1、A2、A3的體外抗氧化活性高于姜黃素。

2.4 姜黃素類似物對K562細胞增殖的體外抑制活性

目標化合物對人的慢性粒細胞性白血病K562細胞的體外活性初步測試結果列于表3。

表3 目標化合物和姜黃素對K562細胞的體外IC50Table 3 IC50of target compounds and curcumin against K562 cells in vitro

姜黃素的抑制腫瘤活性在一定程度上與其抗氧化活性有關［8］，一般來說，在姜黃素類化合物中，抗氧化的活性部位有兩個，一為酚羥基，另一個是β-二酮的亞甲基。A4結構中用吡啶環取代苯環，芳環無羥基取代，發現其活性明顯低于姜黃素，與Junko［9］的研究結果一致。而A1～A3姜黃素類化合物均具有酚羥基和β-二酮結構單元，結果表明都具有抗氧化和抗腫瘤活性;酚羥基取代在芳環鄰位使活性高于在其他位置的取代，上述結果進一步驗證了姜黃素的抑制腫瘤活性在一定程度上與其抗氧化活性有關的觀點，也表明在姜黃素結構中酚羥基的取代位置是發揮作用的主要因素。

1 Kuttan R.Potential anticancer activity of turmeric(Curcuma longa).Cancer Lett，1985，29:197-202.

2 Vajragupta O，Boonchoong P，Morris GM，et al.Active site binding modes of curcumin in HIV-1 protease and integrase.Bioorg Med Chem Lett，2005，15:3363-3368.

3 Aggarwal BB，Kumar A，Bharti AC.Anticancer potential of curcumin:preclinical and clinical studies.Anticancer Res，2003，23:363-398.

4 Wang YJ，Pan MH，Cheng AL，et al.Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products.J Pharm Biomed Anal，1997，15:1867-1876.

5 Robinson TP，Ehlers T，Hubbard RB，et al.Design，synthesis，and biological evaluation of angiogenesis inhibitors:aromatic enone and dienone analogues of curcumin.Bioorg Med Chem Lett，2003，13:115-117.

6 Wu RL(武榮蘭)，Feng S(封順)，Wang JD(王吉德).Study on the inhibition effect of baicalin and baicalin metallic coordination.Sci Technol Rev(科技導報)，2006，24:36-38.

7 Chen WM(陳萬木)，Guo HX(郭宏雄).The effect of substituted groups in benzen ring on the condensation reaction of acetophenones with benzaldehydes.Synth Chem(合成化學)，1999，7:422-426.

8 Barclay LR，Vinqvist MR，Mukai K，et al.On the antioxidant mechanism of curcumin:classical methods are needed to determine antioxidant mechanism and activity.Org Lett，2000，2:2841-2843.

9 Junko I，Hironor O，Yoko T，et al.Bioorg Med Chem，2002，10:3481.

Synthesis and in vitro Antioxidant Activity of Curcumin Analogs

CHEN Li-min，KANG Jian-jun，LIU Yang，LIN You-wen*
Faculty of Pharmacy，fujian medical university，fuzhou，350004

Four curcumin analogs(A1-A4)were synthesized with various aromatic aldehyde and 2，4-pentanedione as raw materials via condensation reactions.The structures of all synthesized compounds were characterized by IR，1H NMR and mass spectra.Antioxidant activity in vitro of curcumin analogs were studied by the pyrogallol autoxidation method.Trypan blue staining assay was used to evaluate the in vitro antitumor activity of these derivatives.The results showed that antioxidant activity and the inhibitory activity of K562 cell proliferation of compounds A1，A3and A4was both higher than that of curcumin.The analysis of structure activity shows that the antioxidant and antitumor activities of curcumin analogs are related to-OH groups of Aromatic ring.

curcumin;analogs;synthesis;antioxidant activity;antitumor activity

1001-6880(2011)04-0722-04

2010-02-02 接受日期:2010-05-11

福建省自然科學基金計劃資助項目(2009J01158)、福建醫科大學教授學術發展基金計劃(JS09004)、福建省教育廳科技項目(JA07083)

*通訊作者 E-mail:linhumor@sina.com

R962;R284.3

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