不同取代度N-鄰苯二甲酰殼聚糖抗氧化活性的研究

孫 濤，銀旭紅，謝 晶，康永鋒，周冬香

上海海洋大學食品學院，上海201306

不同取代度N-鄰苯二甲酰殼聚糖抗氧化活性的研究

孫 濤，銀旭紅，謝 晶，康永鋒，周冬香

上海海洋大學食品學院，上海201306

低聚殼聚糖與鄰苯二甲酸酐酰化得到三種取代度不同的N-鄰苯二甲酸酐酰低聚殼聚糖NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC，取代度分別為0.33、0.55和0.65。通過紅外光譜對其結構進行表征。并考察了其抗氧化性能。結果表明:COS的抗氧化性能最強;隨著取代度的增加，N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖對超氧陰離子的清除能力逐漸升高;而對DPPH的清除能力以及還原能力呈逐漸下降趨勢;對羥基自由基的清除順序大小依次為NPCOSB＞NPCOSA＞NPCOSC，即NPCOSB清除羥基自由基的的能力最佳。

低聚殼聚糖;N鄰苯二甲酰化低聚殼聚糖;抗氧化性

低聚殼聚糖是殼聚糖的降解產物，其結構單元中有大量的-OH和-NH2，具良好的抗氧化活性［1，2］，同時也決定低聚殼聚糖可進行多功能基團的化學反應。低聚殼聚糖改性反應可以在-NH2上進行，也可以在-OH位上進行，且取代位置、取代基團以及取代程度都會直接影響到低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性能。研究發現，N-羧甲基低聚殼聚糖隨著羧甲基在NH2上的取代程度的增加，其對DPPH的清除能力和還原能力下降，對超氧陰離子的清除能力先升高后下降［3］。N-季銨鹽殼聚糖衍生對羥基的清除能力隨著取代度的升高而增強［4］。N-鄰苯二甲酰化低聚殼聚糖是低聚殼聚糖N位酰化后的低聚殼聚糖衍生物，因其具有良好的生物相容性，吸濕、保濕性質以及它可以作為高分子藥物和人造組織等異性生物材料的關鍵中間體而受關注［5，6］。但是其抗氧化，尤其是其抗氧化性與取代度之間的關系還尚見報道。

前期對不同取代度的羧甲基低聚殼聚糖和季銨鹽低聚殼聚糖抗氧化性研究顯示［7-9］，不同殼聚糖衍生物的抗氧化活性呈現出的規律各異，這可能與取代度和取代基團的性質有關。作為一種重要的低聚殼聚糖衍生物，研究N-鄰苯二甲酰化低聚殼聚糖的抗氧化性能，即能完善低聚殼聚糖衍生物的抗氧化機理，同時也希望開發一種更為有效的低聚殼聚糖衍生物抗氧化劑。本實驗以低聚殼聚糖為原料，制備了三種不同取代度的N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖，并研究了其抗氧化能力與取代度程度之間的關系。初步探討了N-鄰苯二甲酰基的取代度對其抗氧化活性的影響規律。

1 實驗部分

1.1 材料

低聚殼聚糖，購自浙江金殼生物化學有限公司(凝膠色譜測定其分子量為5000 Da);魯米諾，DPPH，購自Sigma公司;其余試劑均為分析純，購自上海化學試劑公司。

1.2 低聚殼聚糖衍生物的制備及表征

稱取5.0 g低聚殼聚糖至于反應器，加入100 mL蒸餾水，攪拌溶解，稱取1.0 g鄰苯二甲酸酐，用20 mL丙酮溶解，然后緩慢加入反應器，在室溫下攪拌反應15 h，然后用丙酮沉淀，過濾，產物用丙酮反復洗滌，最后在60℃烘干，得到NPCOSA［10］。保持其他條件不變，分別稱取2.0 g和5.0 g鄰苯二甲酸酐，得到NPCOSB和NPCOSC。

紅外光譜在EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀上進行，采用KBr壓片法制樣，測定波數范圍為500～4000 cm–1，分辨率為0.8 cm–1。

1.3 取代度的測定

準確稱量N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖0.1000 g置500 mL燒杯內，準確加入0.1038 mol/L HCl標準溶液20.00 mL溶解樣品，再加入去離子水200 mL稀釋、混勻，用0.4685 mol/L NaOH標準溶液返滴，測定電導率值。做電導率-氫氧化鈉體積關系圖，添加趨勢線，求其回歸方程，從而計算N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖的取代度［11］。

1.4 對超氧陰離子自由基O-·2的清除

用pH=10.20的0.05 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制濃度為1.5×10–3mol/L的魯米諾溶液，用1×10–3mol/L的鹽酸配制濃度為0.1 mol/L的鄰苯三酚儲備液，使用前用去離子水稀釋至1× 10–4mol/L。以緩沖液作為溶劑，配制成不同濃度的樣品溶液。用流動注射化學發光分析儀依次測定從稀到濃的樣品溶液，讀出峰面積。清除率=(A0－Ai)/A0×100%。式中A0為空白溶液峰面積;Ai為樣品溶液峰面積。經SOD，過氧化氫酶及甘露醇檢測，該體系產生的自由基為超氧陰離子O［12］。

黑龍江省八五○農場坐落于完達山南麓，穆棱河北畔；始建于1954年，總土地面積527 km2，平原區面積363 km2；1997年開始種植水稻，當年種植面積0.87×104hm2，至2017年，井灌水田面積已達到2.43×104hm2，占平原區面積的67%，是地下水開采強度最大的農場。其平原區是第四紀沖積洪積區，地表覆蓋0～4 m的亞砂、亞黏土，下有20～80 m的砂、礫石含水層，是三江平原典型的潛水區。

1.5 對羥基自由基·OH的清除

用pH=7.40的0.05 mol/L KH2PO4-NaOH緩沖溶液分別配制濃度為6.4×10–4mol/L的魯米諾溶液、0.012 mol/L H2O2和0.8 mg/mL亞鐵氰化鉀溶液。以緩沖液作為溶劑，配制成系列不同濃度的樣品溶液。依上述方法測定并計算樣品清除羥基自由基的活性。經SOD，過氧化氫酶及甘露醇檢測，該體系產生的自由基羥基自由基·OH［12］。

1.6 對DPPH自由基的清除

在裝有2.0 mL的濃度為1×10–4mol/L DPPH無水乙醇溶液的比色管中，加入不同濃度的樣品溶液2.0 mL，搖勻，33℃避光靜置半小時，在517 nm處測量吸光度Ai。用去離子水代替樣品溶液，得吸光度A0，無水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj。清除率=［1－(Ai－Aj)/A0］×100%［13］。

1.7 還原能力的測定

還原能力根據文獻［14］測定并稍做改進。取2.0 mL不同濃度的樣品，加入pH=6.6的0.2 mol/ L磷酸緩沖液1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混勻，50℃水浴20 min后迅速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后在2000 r/min下離心10 min，取上清液2.0 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，靜置十分鐘后在700 nm處測定吸光度。

2 結果與討論

2.1 紅外光譜

圖1 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的紅外光譜Fig.1 FTIR spectra of COS，NPCOSA，NPCOSB and NPCOSC

圖1是COS以及其N-鄰苯二甲酰衍生物的紅外圖。3416 cm–1處峰是殼聚糖分子中的醇的VO-H，羧基的VO-H以及酰胺中的VN-H振動峰的合并譜帶。1264 cm–1處是 OH的的彎曲振動吸收峰，1073 cm–1和1023 cm–1處分別是C3仲羥基和C6伯羥基的C-O的伸縮振動吸收峰。1157 cm–1處及894 cm–1處的吸收峰是殼聚糖的β-(1，4)糖苷鍵的特征吸收峰。

與COS相比的紅外圖譜相比［15］，N-鄰苯二甲酰化低聚殼聚糖衍生物在3400 cm–1附近的峰此變窄，并發生紅移，這說明COS中的氨基參加了反應，-NH2減少。1650、1555、1380、1329 cm–1附近的吸收峰強度增大，其中1650 cm–1酰胺Ⅰ的吸收峰，1555 cm–1是酰胺Ⅱ的吸收峰，1380 cm–1是酰胺Ⅲ的吸收峰，1329 cm–1處是C-CH3的變形振動吸收帶，這證明了鄰苯二甲酸酐與殼聚糖的酰化反應是發生在-NH2上。隨著取代度的增加，在1710 cm–1處，鄰苯二甲酸酐峰越來越明顯;在750 cm–1附近的吸收峰為鄰二取代苯的δAr-H面外彎曲振動峰，而在殼聚糖中未見此峰，這些證實了衍生物中羧基苯甲酰基的存在［16］。進一步證實了殼聚糖發生了鄰苯二甲酰化反應。電導法測得NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的取代度分別是0.33、0.55和0.65。

2.2 對超氧陰離子自由基O-·2的清除

圖2 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC對超氧陰離子的清除Fig.2 Scavenging effects of COS，NPCOSA，NPCOSB and NPCOSC on superoxide anion

圖2是COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC對超氧陰離子的清除曲線圖。從圖上可以看出，隨著濃度的升高，它們對超氧陰離子的清除能力增強。COS清除超氧陰離子能力最強。三種衍生物對超氧陰離子清除能力沒有明顯的差異，大小順序依次為NPCOSC＞NPCOSB＞NPCOSA。

低聚殼聚糖及其衍生物清除自由基的能力可能與羥基和氨基的數目以及羥基和氨基的活性有關。與鄰苯二甲酰低聚殼聚糖衍生物相比，低聚殼聚糖含有的氨基和羥基的數目最多，故對超氧的清除能力最強。而鄰苯二甲酰殼聚糖衍生物，隨著取代度的增大，對超氧的清除能力逐漸增強。這可能是由于吸電子基團-COC6H4COO–的引入，降低了COS主鏈上的電子云密度，從而降低了羥基和氨基生成氫鍵的幾率，使得氨基和羥基的活性增強，易于與超氧反應。所以，隨著取代度的增加，盡管氨基的數目的減少，但對超氧的清除能力增強。

2.3 對羥基自由基·OH的清除

圖3 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC對羥基自由基的清除Fig.3 Scavenging effects of COS，NPCOSA，NPCOSB and NPCOSC on hydroxyl radical

圖3是COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC對羥基自由基的清除曲線圖。由圖可知，所有樣品對羥基自由基的清除能力都是隨著濃度的升高而增強。COS、NPCOSA、NPCOSB對羥基自由基的半抑制濃度分別為0.26、0.30、0.42 mg/mL，而NPCOSC對羥基自由基的清除能力未達到50%。COS清除羥基的能力最強，鄰苯二甲酰衍生物對羥基自由基的清除能力大小依次為 NPCOSB＞NPCOSA＞NPCOSC，這不同于它們對超氧的清除能力。這是由于與超氧陰離子不同，羥基自由基是一種很活潑的自由基，因此對引進基團-COC6H4COO–所產生的空間位阻很敏感。因此鄰苯二甲酰衍生物對羥基的清除能力是氨基數目，-COC6H4COO–的電子效應及空間位阻三者綜合作用的結果。

2.4 對DPPH的清除活性

圖4 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC對DPPH自由基的清除Fig.4 Scavenging effects of COS，NPCOSA，NPCOSB and NPCOSC on DPPH radicals

圖4為低聚殼聚糖及其N-鄰苯二甲酰衍生物對DPPH自由基的清除曲線圖。由圖可知，隨著濃度的升高，COS，NPCOSA和NPCOSB對DPPH的清除能力增強，而NPCOSC在濃度達到1.30 mg/mL后，隨著濃度的繼續升高，對DPPH的清除能力下降。COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC對DPPH的半抑制濃度分別為:0.36、0.53、0.74 mg/mL和0.89 mg/mL。隨著取代度的升高，NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC清除DPPH的能力逐漸下降。

DPPH是一種相當穩定的自由基，可接受氫或電子形成穩定的分子。殼聚糖分子鏈中的活性氨基和羥基可以提供氫與DPPH結合，從而達到清除DPPH的目的。隨著取代度的升高，活性氨基越少，供氫能力越弱，故 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC對DPPH的清除能力依次減弱。此解釋同樣適合于COS及其N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖衍生物的還原能力。

2.5 還原能力

圖5 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的還原能力Fig.5 Reducing power of COS、NPCOSA、NPCOSB and NPCOSC

圖5是COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的還原能力的曲線圖。從圖可以看出，當樣品濃度為2.50 mg/mL時，COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的吸光值依次為0.85、0.64、0.44和0.40。COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的還原能力依次減弱。這表現與對DPPH的清除能力一樣的規律。COS上的氨基被鄰苯二甲酸酐取代后，活性氨基數目減少，且隨著取代度的升高，活性氨基的數目減少，供電子能力下降，故還原能力下降。

3 結論

本文對低聚殼聚糖進行酰化改性，制備了取代度不同的三種N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖，并考察了它們對超氧陰離子，羥基自由基，DPPH的清除能力以及還原能力。結果表明:N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性與殼聚糖相比，有所降低。

N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性不但與羥基和氨基的數目有關，還與羥基和氨基的活性有關。N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖衍生物中引進-COC6H4COO–，會影響氨基和羥基的活性，從而影響到N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性能。本實驗對殼聚糖及其衍生物抗氧化機理的深入研究和天然抗氧化劑的開發利用提供了相關依據和理論思路。

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Antioxidant Activity of N-Phthaloyl-Chitosan Oligosaccharide with Different Substituting Degrees

SUN Tao，YIN Xu-hong，XIE Jing，KANG Yong-feng，ZHOU Dong-xiang
College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306

N-phthaloyl chitosan oligosaccharides(NPCOSA，NPCOSB and NPCOSC)，having various degrees of substitution(DS were 0.33，0.55 and 0.65，respectively)were prepared by chemical modification of chitosan oligosaccharide.The chemical structures of the chitosan oligosaccharides derivatives were characterized by FTIR.Their antioxidant activities were evaluated by the scavenging of superoxide anion radicals(O)，hydroxyl radical(·OH)，DPPH radical and deter mination of reducing power.The results indicated that all the N-phthaloyl chitosan oligosaccharides showed lower antioxidant activity than chitosan oligosaccharides，the scavenging effect on Oincreased with the increasing of DS，and their scavenging effect on DPPH and reducing power both were decreased with the increasing of DS;the order of their scavenging effect on·OH was NPCOSB＞NPCOSA＞NPCOSC，and the NPCOSB showed the strongest scavenging effect on·OH.

chitosan oligosaccharide;N-phthaloyl chitosan oligosaccharide;antioxidant

1001-6880(2011)04-0713-05

2009-11-16 接受日期:2010-04-21

上海市教委重點學科建設項目(J50704)，上海市重點學科建設項目專項基金(T1102)，上海市生物醫藥和農業科技領域重點科技項目(08391911500)，2009年上海市優秀學科帶頭人計劃(09XD1402000)

*通訊作者 Tel:86-21-61900363;E-mail:taosun@shou.edu.cn

TS202.3

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