共軛亞油酸對脂肪代謝相關基因表達的影響

李杰梅，徐娟娟，楊得坡，陳家樹，3*

1中山大學新華學院，廣州510520; 2中山大學藥學院天然藥物與中藥研究所，廣州510006;3中山大學醫學院，廣州510080

共軛亞油酸對脂肪代謝相關基因表達的影響

李杰梅1，徐娟娟1，楊得坡2，陳家樹1，3*

1中山大學新華學院，廣州510520;2中山大學藥學院天然藥物與中藥研究所，廣州510006;3中山大學醫學院，廣州510080

本文利用實時定量PCR的測定方法，分析了兩種共軛亞油酸(CLA)異構體對3T3-L1小鼠前脂肪細胞脂肪代謝相關基因表達的影響。本研究CLA異構體的處理濃度和時間為75.4 μmol/L，8 d，測定了與能量代謝、細胞凋亡、脂肪酸氧化作用和脂解作用相關的多種基因的mRNA水平。結果顯示:兩種異構體均能夠顯著提高UCP1、UCP3、Perilipin和PPARα的mRNA水平，而抑制UCP2的表達水平(P＜0.01)。與cis-9，trans-11 CLA相比，trans-10，cis-12 CLA顯著提高PKA(P＜0.05)、CPT-1和TNF-α(P＜0.01)的mRNA水平。與對照組相比，兩種CLA異構體處理組均對HSL、ATGL、ACO和Leptin的基因表達無顯著影響。

共軛亞油酸;異構體;熒光定量PCR;3T3-L1

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是亞油酸的一組位置和幾何異構體的通稱，其中 cis-9，trans-11和trans-10，cis-12 CLA是兩種常見CLA異構體，此兩者都是天然產物，其中cis-9，trans-11CLA是飲食CLA的主要形式。CLA具有抑癌、減肥、調節血脂、抗動脈粥樣硬化、免疫調節等多種生理功能［1-4］。

目前應用最廣泛的前脂肪細胞系是3T3-L1、3T3-F442和Ob17，它們均是體外實驗的理想研究對象。本文選擇3T3-L1細胞作為研究CLA異構體降脂作用的實驗材料。在以往的研究報道中，以CLA處理細胞的時間較短(1～3 d)，而常見的有效處理濃度為50 μmol/L及100 μmol/L［5-7］，本研究以75.4 μmol/L的CLA進行處理，并通過實時定量PCR(quantitative real-time reverse transcriptase PCR，RT-PCR)分析相應mRNA水平的變化，目的是研究兩種CLA異構體對能量代謝、細胞凋亡、脂肪酸氧化和脂解作用相關基因的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

CLA單體 (cis-9，trans-11和 trans-10，cis-12 CLA)，純度為98%，購自南昌華興生物科技有限公司。3T3-L1細胞株由中山大學生科院寄生蟲學研究室提供，為第7～8代細胞。

主要試劑:DMEM培養基、胎牛血清、DMSO、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素均為Sigma公司產品;提取總RNA的TriZol試劑為美國Invitrogen公司產品;逆轉錄試劑Oligo-dT、dNTPs由大連寶生生物工程有限公司提供;逆轉錄酶M-MLV為Promega公司產品;SYBR Green PCR Master Mix為Toyobo公司產品。

主要儀器:CO2培養箱(Thermo Electron公司); BioPhotometer 6131型核酸蛋白檢測儀 (德國Eppendorf公司);PTC-200 PCR儀(A＆B公司);ABI prism 7900型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)。

1.2 細胞培養方案

3T3-L1前脂肪細胞的培養方法:以培養孔數為12的細胞培養板培養細胞，培養液是含有10%胎牛血清的DMEM溶液，在溫度為37℃、含5%CO2的培養箱中培養至細胞融合。細胞融合兩天后，換以含有0.1 μmol/L地塞米松、1 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.1 μmol/L胰島素、10%胎牛血清的DMEM培養基，刺激分化，培養48 h，并把加入誘導分化液當日設為第0 d。之后撤去3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和地塞米松，使完全培養液中只含有0.1 μmol/L胰島素;2 d后撤去胰島素，使用不含有任何誘導劑的完全培養基。

以DMSO分別溶解CLA兩異構體，均配制成藥物濃度為75.4 μmol/mL的儲備液。每孔培養液的溶液量為2 mL，加入CLA儲備液的量為2 μL，則加入到處理組的細胞培養液中時，CLA異構體的最終濃度為75.4 μmol/L，同時DMSO在細胞培養液的最終濃度僅為0.1%。從第2 d至第10 d，每天換液，對照組則加入相同體積、不含CLA的DMSO溶液，每個處理組均含有6個重復。倒置顯微鏡下觀察前脂肪細胞分化情況，提取RNA用作實時熒光定量PCR分析，CLA對脂肪細胞的影響作用通過與空白對照組比較而得出。

1.3 引物和探針的設計合成

引物由上海申能博彩生物科技有限公司負責設計并合成，引物序列等情況見表1。

表1 試驗基因的引物設計Table 1 Primers for RT-PCR

1.4 組織樣品總RNA的提取

采用Trizol法。

1.5 總RNA純度及濃度的測定

采用BioPhotometer 6131型核酸蛋白檢測儀，在OD260 nm下測定RNA的純度及濃度，選擇吸光度比值OD260 nm/OD280 nm＞1.9的總RNA進行試驗。

1.6 組織樣品cDNA合成和檢驗

取5 μL RNA工作液，加入3 μL Oligo-dT，加入12 μL DEPC處理水至20 μL;70℃變性5 min后，立即冰浴2 min，再與逆轉錄體系中其他物質混合，加入5×RT Buffer 10 μL，dNTPs(10 mmol)3 μL，M-MLV 2 μL，RNasin 0.6 μL，補充DEPC水至總體積為50 μL。

逆轉錄反應的PCR條件為:42°C 50 min，70°C 10 min，4°C 5 min。取出后短暫離心，cDNA置-20℃保存。為檢驗樣品cDNA，用小鼠β-actin的引物進行PCR擴增，以1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ mL EB)電泳檢測PCR產物，如圖所示，擴增條帶長度約為500 bp，與文獻［8］報道的結果相似。

圖1 β－actin的PCR擴增結果Fig.1 PCR analysis of β－actin

1.7 實時熒光定量PCR反應

20 μL反應體系中含有模板cDNA 1 μL，SYBR Green PCR Master mix 10 μL，sense-primer 0.5 μL，anti-sense-primer 0.5 μL，RNAase-free水8 μL，循環參數為:95℃10 min;95℃15 s，60℃1 min，40個循環。反應結束后做產物的熔解曲線分析，檢驗PCR產物的特異。以β-actin作為內參，根據被測基因與內參基因的 Ct差值，以對照組的表達量為100%，以相對量的方式表示。

1.8 數據處理及統計分析

被測基因的相對定量按公式得出:被測基因 = 2—(△△Ct)，其中△△Ct=(△Ct，Q)—(△Ct，C)。△Ct，Q為處理組被測基因的Ct值與管家基因Ct值之差;△Ct，C為對照組被測基因的Ct值與管家基因Ct值之差。測定△Ct值以±s表示，以SPSS軟件進行統計分析，組間差異采用成組t檢驗，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

觀察前脂肪細胞分化情況:倒置顯微鏡下觀察，分化前3T3-L1前脂肪細胞呈梭形，胞漿內無脂滴，對照組分化后細胞呈圓形，胞漿內可見大量的脂滴，脂滴聚集于核周。誘導分化后第10 d，對照組3T3-L1前脂肪細胞90%呈脂肪細胞表型。cis-9，trans-11處理組細胞觀察結果與對照組接近，trans-10，cis-12 CLA處理組則有明顯變化，細胞體積明顯較小，說明前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化的過程受到了抑制。

實時熒光定量PCR的分析結果見圖2和表2。

cis-9，trans-11 CLA處理組中，UCP1、UCP3和PPARα的mRNA表達量比對照組增加一倍 (P＜0.05)，Perilipin的表達量則增加64%(P＜0.05)。UCP2的mRNA表達水平極顯著降低(P＜0.01)，僅為對照組的31.3%。其余基因的mRNA表達量并未受cis-9，trans-11 CLA顯著影響。

trans-10，cis-12 CLA對脂類代謝相關基因的mRNA表達有更大的影響。UCP1的mRNA表達量比對照組增加了4.39倍，UCP3、PPARα和Perilipin的mRNA水平則分別增加了5.86倍、5.3倍和5.57倍，以上的變化極其顯著(P＜0.001)，而UCP2的mRNA表達水平減少為對照組的1/4(P＜0.01)。trans-10，cis-12異構體使CPT-1和TNF-α的mRNA水平分別提高到對照組水平的2.82和3.62倍(P＜0.01)，同時也使PKA的mRNA表達增加了73.6 %(P＜0.05)。但是，trans-10，cis-12 CLA對于HSL、ATGL、ACO和Leptin表達的影響卻不顯著。

圖2 脂肪細胞的RT－PCR分析結果Fig.2 mRNAs levels of 3T3－L1 cells by RT－PCR

3 討論

解偶聯蛋白(UCPs)與機體能量平衡的調控密切相關，尤其是已證實UCP1基因的上調能提高機體能量代謝［9］。本研究中兩種CLA異構體處理組中，UCP1、UCP3基因表達增加，而UCP2的mRNA水平降低，并且trans-10，cis-12 CLA(P＜0.001)的影響強于cis-9，trans-11 CLA(P＜0.01)。trans-10， cis-12 CLA使UCP1的mRNA表達量增加的作用與LaRosa等所報道的結果相同［10］。

表2 脂肪細胞的RT-PCR分析結果Table 2 mRNA levels of 3T3-L1 cells by RT-PCR

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)表達的增加能上調脂酰輔酶A氧化酶(ACO)和肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1(CPT-1)的表達，因此，PPARα的激活程度反映了脂肪酸β-氧化的程度［11］。本研究中，CLA的兩種異構體均能上調PPARα的mRNA水平，并且相較而言，cis-9，trans-11 CLA的影響程度較小(P＜0.01)，trans-10，cis-12 CLA的影響程度較大(P＜0.001)。CPT-1基因表達上調在trans-10，cis-12 CLA處理組中較為明顯(P＜0.01)。而對于脂酰輔酶A，兩種異構體均趨于抑制ACO的表達。

腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種已知能明顯抑制脂肪細胞分化、促進脂水解和脂肪細胞凋亡的細胞因子［12］，而且TNF-α的水平會因為CLA的處理而增加［13］。本研究得到相似的結果，TNF-α表達水平的提高僅在trans-10，cis-12 CLA處理組中出現(P＜0.01)，因此脂肪細胞的凋亡也很可能發生在trans-10，cis-12 CLA處理組中。但是，僅有TNF-α表達水平的上升還不能直接說明 trans-10，cis-12 CLA具有促凋亡作用，還需要繼續研究其他與細胞凋亡周期相關的細胞因子的情況。

一般而言，TNF-α對Leptin的表達具有促進作用，后者能上調與脂肪酸氧化相關酶類以及其轉錄因子的表達、誘導脂細胞凋亡。但實驗結果和以往的報道一樣［14］，顯示trans-10，cis-12 CLA具有減少Leptin mRNA表達水平的傾向。即在處理組中出現了TNF-α和Leptin基因表達水平變化并不一致的情況，Leptin的表達水平顯然受到了其他因素的影響。

脂周包被蛋白(Perilipin)在油滴表面起屏障作用，磷酸化后屏障作用消失，加速激素敏感脂酶(HSL)從胞漿向脂滴轉位，進而促進甘油三酯水解［15］。蛋白激酶A(PKA)對Perilipin和HSL均有磷酸化作用，磷酸化的Perilipin和HSL能促進脂解作用［16］。作為一種重要的新脂酶，脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)主要參與水解甘油三酯的第一步。PKA、Perilipin、HSL和ATGL基因均和脂解作用有關，分析這些基因mRNA表達水平的數據，發現長時間以高劑量的trans-10，cis-12CLA能提高PKA(P＜0.05)和Perilipin(P＜0.001)的表達水平，而對HSL和ATGL無明顯影響。cis-9，trans-11 CLA除能提高Perilipin(P＜0.05)的表達水平外，對其余三種基因均無明顯影響。

綜上所述，通過實時熒光定量PCR比較兩種異構體對與脂肪酸代謝相關基因表達水平的影響，初步判斷cis-9，trans-11 CLA對脂肪細胞能量代謝具有促進作用，但是不影響細胞凋亡、脂肪酸氧化和脂解作用。而trans-10，cis-12 CLA雖然對脂解作用無明顯影響，但是卻對能促進與能量代謝、誘導細胞凋亡和脂肪酸氧化相關基因的表達。

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Effects of Conjugated Linoleic Acid Isomers on Gene Expression of Proteins Involved in Lipid Metabolism

LI Jie-mei1，XU Juan-juan1，YANG De-po2，CHEN Jia-shu1，3*1Xinhua College of Sun Yat-sen University，Guangzhou，510520，China;2Institute of Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine，Sun Yat-sen University，Guangzhou，510006，China;3School of medicine，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China

RT-PCR was employed to determine isomer-specific effects of two conjugated linoleic acid(CLA)isomers on enzymes involved in lipid metabolism in cultured 3T3-L1 adipocytes.Concentration of either isomer was 75.4 μmol/L and treatment period was 8 days.mRNA levels of proteins involved in energy expenditure，apoptosis，fatty acid oxidation and lipolysis were identified.The results showed that gene expression of UCP1，UCP3，Perilipin and PPAR increased whereas UCP2(P＜0.01)reduced for both CLA isomers.And compared with treatment of cis-9，trans-11 CLA，trans-10，cis-12 CLA significantly up-regulated mRNA levels of PKA(P＜0.05)，CPT-1 and TNF-α(P＜0.01).Compared with control，both isomers did not significantly influence gene expression of HSL，ATGL，ACO and Leptin.

conjugated linoleic acid;isomer;quantitative real-time reverse transcriptase PCR;3T3-L1

1001-6880(2011)04-0704-05

2010-09-06 接受日期:2010-12-13

*通訊作者 Tel:86-20-87065055;E-mail:mary1102357@hotmail.com

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