樹(shù)形分子修飾的碳納米管顆粒轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞BxPC3安全性的研究

程?hào)|峰 吳旭波 王加祥 韓寶三 張雪清 楊浩 袁恒光 朱萍 彭承宏

·論著·

樹(shù)形分子修飾的碳納米管顆粒轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞BxPC3安全性的研究

程?hào)|峰 吳旭波 王加祥 韓寶三 張雪清 楊浩 袁恒光 朱萍 彭承宏

目的觀察單壁碳納米管-聚酰胺樹(shù)形分子復(fù)合物(CNT-PAMAM-D)進(jìn)入胰腺癌細(xì)胞的過(guò)程，評(píng)價(jià)其作為載體的安全性。方法通過(guò)超聲、攪拌及洗滌等方法制備CNT-PAMAM-D，用原子力顯微鏡和透射電鏡觀察其形態(tài)。將CNT-PAMAM-D與人胰腺癌細(xì)胞BxPC3共同培養(yǎng)12、48、72 h，收集細(xì)胞，在透射電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)CNT-PAMAM-D的分布及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果PAMAM-D與CNT結(jié)合之后，樹(shù)形分子包裹在CNT的表面，形成了20 nm左右大小的納米復(fù)合物顆粒。CNT-PAMAM-D通過(guò)細(xì)胞吞飲方式被吞入BxPC3細(xì)胞，12 h后即大量進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，CNT-PAMAM-D還可進(jìn)入溶酶體及細(xì)胞核中，但胰腺癌細(xì)胞的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)無(wú)顯著變化。結(jié)論CNT-PAMAM-D是一種高效、安全的納米載體。

胰腺腫瘤； 碳納米管； 樹(shù)形分子； 透射電子顯微鏡檢查； 載體

納米技術(shù)是當(dāng)前發(fā)達(dá)國(guó)家投入最多、發(fā)展最快的科學(xué)研究和技術(shù)開(kāi)發(fā)領(lǐng)域[1]，有關(guān)納米顆粒與細(xì)胞之間相互作用的研究也才剛剛開(kāi)始。碳納米管(carbon nanotube, CNT)[2]和樹(shù)形分子(dendrimer)[3-5]是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型多功能納米材料。本研究觀察碳納米管-樹(shù)形分子復(fù)合物轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞的過(guò)程及其對(duì)癌細(xì)胞的影響，探討樹(shù)形分子修飾的碳納米管作為載體的安全性。

材料與方法

一、碳納米管-樹(shù)形分子復(fù)合物的制備及表征

將0.1 mg單壁CNT(深圳市納米港有限公司)分散于5 ml H2SO4/HNO3(3∶1)混合酸中，室溫下超聲處理5 h，然后攪拌24 h，過(guò)濾除去混合酸，用蒸餾水洗滌3次后，分散于2.0 ml蒸餾水中，置120℃高壓滅菌25 min，加入1.0 ml 1 mmol/L的4.0代聚酰胺-樹(shù)形分子(polyamidoamine dendrimer， PAMAM-D)水溶液(上海交通大學(xué)微納米科學(xué)技術(shù)研究院生物納米工程研究室提供)，室溫下超聲2 h，攪拌24 h，用0.22 μm碳酸酯膜過(guò)濾并洗滌3次，除去過(guò)量的PAMAM-D，獲得CNT-PAMAM-D，調(diào)整濃度為10 g/ml。

取適量CNT-PAMAM-D滴加到云母片表面，干燥后，用原子力顯微鏡(atom force microscopy,AFM)直接觀察；同樣，適量的樣品滴加到銅網(wǎng)表面，自然干燥后，用透射電鏡(TEM，JEM-100CXII，JEOL)直接觀察。

二、CNT-PAMAM-D轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞

人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所。 常規(guī)培養(yǎng)后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BxPC3細(xì)胞接種于10個(gè)直徑10 cm的培養(yǎng)皿，每個(gè)皿2×105個(gè)細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜。次日棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液10 ml。分成CNT-PAMAM-D組和對(duì)照組，分別加入CNT-PAMAM-D水溶液或生理鹽水300 μl，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48、72 h。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)。然后棄培養(yǎng)液，PBS液清洗后以1%鋨酸固定，Spurr包埋劑包埋，LKB超薄切片機(jī)切片，透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

結(jié) 果

一、CNT-PAMAM-D的結(jié)構(gòu)特征

PAMAM-D與CNT結(jié)合之后，樹(shù)形分子包裹在CNT的表面，形成了20 nm左右大小的復(fù)合物顆粒(圖1)。

圖1單壁碳納米管(a)、PAMAM樹(shù)形分子(b)及CNT-PAMAM樹(shù)形分子復(fù)合物(c)形態(tài) (原子力顯微鏡)

二、CNT-PAMAM-D進(jìn)入人胰腺癌細(xì)胞的過(guò)程

首先，CNT-PAMAM-D黏附在細(xì)胞表面(圖2a)，然后胰腺癌細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞吞飲方式將CNT-PAMAM-D吞入(圖2b)。12 h后CNT-PAMAM-D分布在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周?chē)?圖2c)，部分被溶酶體吞噬。36 h后，CNT-PAMAM-D不僅位于胞質(zhì)，還定位于胞核中(圖2d)。72 h后，細(xì)胞形態(tài)仍完好，細(xì)胞器、胞核的核膜及線粒體結(jié)構(gòu)均完整，但有溶酶體吞噬殘?bào)w，部分細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在的空泡囊，泡內(nèi)含有顏色較深的小顆粒(圖2e)。

圖2CNT-PAMAM-D復(fù)合物先黏附細(xì)胞膜(a ×17000)，然后被細(xì)胞吞飲(b ×33000)；12 h后位于細(xì)胞質(zhì)中，部分被溶酶體吞噬(c ×9700)；36 h后出現(xiàn)在胞核中(d ×5800)；72 h后胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在空泡囊，內(nèi)含深色顆粒，可見(jiàn)溶酶體吞噬殘?bào)w(e ×17500)

討 論

傳統(tǒng)采用的病毒載體基因治療技術(shù)存在轉(zhuǎn)染效

率低、有免疫原性和潛在的致瘤性，出于安全性等考慮，已經(jīng)在臨床上被禁止使用[6-7]。開(kāi)發(fā)無(wú)毒而高效的基因載體越來(lái)越受到重視。近年來(lái)納米載體己被視為突破基因轉(zhuǎn)移瓶頸最有前途的技術(shù)之一[8]。納米載體無(wú)免疫原性和細(xì)胞毒性，具有很高的基因轉(zhuǎn)移效率，可濃縮、保護(hù)和緩釋所載基因，在體內(nèi)可生物降解[9-10]。

CNT是一類高硬度、穩(wěn)定、中空的一維大分子納米材料，分子動(dòng)力學(xué)模擬與實(shí)驗(yàn)都已證實(shí)CNT能夠攜帶核酸或蛋白質(zhì)等分子快速自由進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核。但CNT含有一些金屬催化劑，如鐵、鎳等，當(dāng)這些物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞之后可能會(huì)引發(fā)氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)氧化氫及自由基，損傷DNA，進(jìn)而損傷細(xì)胞。Cui等[11]實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)CNT處理的細(xì)胞，其黏附性能會(huì)受到嚴(yán)重影響，進(jìn)而引起細(xì)胞脫壁、懸浮和皺縮，同時(shí)CNT會(huì)引起凋亡相關(guān)基因上調(diào)，使細(xì)胞阻滯在G1期，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

PAMAM-D是合成的、 高分枝的、 球形的、 單粒分散的納米大分子，是一類新型陽(yáng)離子多聚物高分子聚合物，其結(jié)構(gòu)參數(shù)如尺寸、外形、表面化學(xué)都可以在合成的過(guò)程中獲得完全控制[12]。在生理?xiàng)l件下，通過(guò)其表面所攜帶的胺基正電荷陽(yáng)離子與細(xì)胞膜表面帶有負(fù)電荷的糖蛋白及磷脂相互作用，以胞飲方式進(jìn)入胞質(zhì)。樹(shù)形分子還可誘發(fā)脂質(zhì)雙層出現(xiàn)納米孔，提高其轉(zhuǎn)染效率。PAMAM- DNA復(fù)合物可以穿越包括網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和血-腦屏障等多種生物屏障，到達(dá)各特殊部位，因此是一種高效的基因遞送載體。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明， PAMAM比其他陽(yáng)離子載體粒徑小、Zeta電位高，更有利于通過(guò)細(xì)胞吞飲方式進(jìn)入細(xì)胞，基因轉(zhuǎn)染效率高于其他陽(yáng)離子載體[13-14]，并具有良好的生物相容性、無(wú)免疫性。樹(shù)形分子修飾CNT后，通過(guò)靜電作用能有效保護(hù)DNA免遭核酸酶的降解，降低CNT對(duì)細(xì)胞的毒性作用，因此，CNT與樹(shù)形分子組合在一起，應(yīng)該是一種非常有前景的、安全高效的基因遞送載體[15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰腺癌細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞吞飲方式將CNT-PAMAM-D吞入細(xì)胞中。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，CNT-PAMAM-D不僅位于胞質(zhì)，還可進(jìn)入胞質(zhì)中的溶酶體及胞核中，而胰腺癌細(xì)胞形態(tài)始終完好，表明CNT-PAMAM-D對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯損傷，是具有良好應(yīng)用前景的微載體物質(zhì)。

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2010-08-26)

(本文編輯：呂芳萍)

Morphologicalchangesofpancreaticcancercellstransfectedbydendrimermodifiedcarbonnanotubes

CHENGDong-feng,WUXu-bo,WANGJia-xiang,HANBao-san,ZHANGXue-qing,YANGHao,YUANHeng-guang,ZHUPing,PENGCheng-hong.

DepartmentofGeneralSurgery,RenjingHospital,MedicalSchool,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China

WUXu-bo,Email:xubowu@yahoo.cn

ObjectiveTo observe the process of polyamidoamine dendrimer modified single walled carbon nanotubes complexes (CNT-PAMAM-D) entering into pancreatic cancer BxPC3 cells, and to evaluate its safety as a vector.MethodsThe CNT-PAMAM-D were prepared by ultrasound, mixing and rinsing, and the morphology was characterized by atom force microscopy and transmission electron microscope. Then the prepared CNT-PAMAM-D was incubated with human pancreatic cancer cell line BxPC3 cells for 12, 48, 72 hours, and then the cells were collected. Distribution of CNT-PAMAM-D in cells and cell ultrastructure was observed by transmission electron microscopy.ResultsAfter the combination of PAMAM-D and CNT, the surface of CNT was surrounded by dendrimer and nanocomposite particles with a size of 20 nm was formed. It was showed that CNT-PAMAM-D could be transfected into human pancreatic cancer cells by cell pinocytotic way, and it entered cytoplasm at 12 h. With the extension of the transfecting time, CNT-PAMAM-D could enter lysosomal and nucleus, but the morphology and ultrastructure ocf BxPC 3 cells was not significantly changed.ConclusionsThe CNT-PAMAM-D is a highly effective and safe nano vector.

Pancreatic neoplasms; Carbon nanotubes; Dendrimer; Transmission electron microscopy; Vector

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.012

上海市科委基金項(xiàng)目(09140902300，10411968500)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30772105)

200025 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院普外科，消化外科研究所(程?hào)|峰、王加祥、韓寶三、彭承宏)；上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院(吳旭波)；上海交通大學(xué)微納米科學(xué)技術(shù)研究院(張雪清、楊浩、袁恒光)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡教研室(朱萍)

吳旭波，Email：xubowu@yahoo.cn