S100A6基因沉默對胰腺癌細胞侵襲的影響

王曉燕 周永靜 龔丹丹 許亞平 徐岷 范鈺

·論著·

S100A6基因沉默對胰腺癌細胞侵襲的影響

王曉燕 周永靜 龔丹丹 許亞平 徐岷 范鈺

目的探討S100A6基因沉默對胰腺癌細胞侵襲的影響和可能機制。方法將不同濃度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)的靶向S100A6的小干擾RNA(S100A6-siRNA)轉染人胰腺癌BxPC3細胞，分別采用熒光實時定量PCR和蛋白質印跡法檢測S100A6 mRNA和蛋白的表達，采用Transwell小室檢測癌細胞侵襲能力，明膠酶譜法檢測基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)活性。結果S100A6-siRNA轉染組細胞的S100A6 mRNA和蛋白表達呈濃度、時間依賴性明顯下調，穿膜細胞數呈濃度依賴性明顯減少。12.5 nmol/L的S100A6-siRNA轉染組細胞轉染后48 h的S100A6 mRNA表達從對照組的(100±0.3)%降到(15.3±0.2)%(P<0.01)；S100A6蛋白的表達從(83.2±0.18)%降到(13.5±0.12)%(P<0.01)；穿膜細胞數從(44.5±2.2)個降到(7.6±1.5)個(P<0.05)。同時，S100A6-siRNA轉染組細胞的MMP-9活性明顯下調。結論抑制S100A6基因表達可抑制胰腺癌細胞侵襲轉移，其機制可能與下調MMP-9活性有關。

胰腺腫瘤； S100A6； 腫瘤侵潤； 基質金屬蛋白酶類

S100蛋白家族是一個有21個成員的鈣結合蛋白家族，S100A6蛋白是其成員之一。研究發現，S100A6蛋白在一些實體瘤如大腸癌、肺腺癌和骨肉瘤中高表達，且與癌細胞侵襲有關。同樣，S100A6在胰腺癌中高表達，而癌旁組織無表達[1-2]，且與癌細胞侵襲及不良預后密切相關[3-5]，但其分子機制尚不清楚。本研究以靶向S100A6基因小干擾RNA(siRNA)轉染胰腺癌BxPC3細胞，觀察其對胰腺癌細胞侵襲的影響，探討其可能的機制。

材料和方法

一、細胞培養及轉染

人胰腺癌BxPC3細胞株為本院組織細胞生物庫凍存，常規培養傳代。取1.0×105個對數生長期細胞接種于24孔培養板，1 ml/孔。待細胞達到70%融合時，分為對照組、脂質體組和S100A6-siRNA組。S100A6-siRNA根據文獻[5]設計，靶點區域為AAGCTGCAGGATGCTGAAATT，由美國Dharmacon公司合成。應用LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)將不同濃度(3.125、6.25、12.5 nmol/L) 的S100A6-siRNA轉染細胞，按說明書操作。對照組未經任何處理；脂質體組僅在培養液中添加LipofectamineTM2000。每組設3個復孔。轉染后24、48、72 h分別采用胰酶消化收集細胞。

二、胰腺癌細胞S100A6 mRNA 和蛋白的檢測

收集的細胞以Trizol抽提總RNA。取總RNA 1 μg，以oligo dT(15 mer)為引物逆轉錄合成cDNA，以此cDNA為模板進行定量PCR，步驟和PCR反應條件參照文獻[6]。S100A6上游引物5′-AAGCTGCAGGATGCTGAAAT-3′；下游引物5′-CCCTTG-AGGGCTTCATTGTA-3′。GAPDH為內參。mRNA表達的定量方法參照文獻[6]。

收集各組細胞，提取細胞總蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測S100A6蛋白的表達，以β-actin為內參。利用Kodak Digital Science 1D圖像分析軟件測定條帶灰度值，以S100A6與β-actin條帶的灰度百分值作為S100A6蛋白的相對表達量。

三、體外侵襲實驗

使用BD公司生產的濾膜包被Matrigel的侵襲小室。上、下室各加入37℃的無血清培養液0.5 ml，置培養箱內靜置2 h后棄培養液。上室分別加入500 μl無血清培養基懸浮的2.5×104/ml的各組BxPC3細胞，下室加入500 μl含10%FBS的培養基。將侵襲小室置于24孔培養板內常規培養48 h。每組3個小室。用棉拭子去除上室未穿膜細胞，用4%甲醛固定濾膜30 min，PBS漂洗2次，0.5%結晶紫染色30 min，PBS沖洗。隨機選擇5個200倍視野，計算總細胞數，取3個小室的均值表示腫瘤細胞的侵襲能力。

四、MMP-9活性檢測

采用明膠酶譜方法檢測。收集50 μl培養上清，加入10 μl樣品緩沖液，混勻后不加熱直接在含1 mg/ml明膠蛋白的10%聚丙烯酞胺凝膠上行垂直電泳。電泳結束后將凝膠置于培養皿中，加入100 ml 2.5%Triton-X 100振蕩，重復洗6次，每次5 min。再用Tris-HCl緩沖液(pH7.4)沖洗3次，每次5 min。之后將凝膠放入反應液中[50 mmol/L Tris(pH 7.4)、200 mmol/L NaCl、10 mmol/L CaCl2)]置37℃培養24 h，考馬斯亮藍R250染色4 h后用脫色液(30%甲醇、10%冰醋酸)脫色，直至出現明顯、清晰的負染酶帶。

五、統計學處理

結 果

一、S100A6-siRNA對BxPC3細胞S100A6 mRNA和蛋白表達的影響

S100A6-siRNA組細胞的S100A6 mRNA和蛋白表達呈濃度和時間依賴性降低(P值均<0.01，表1)。

表1 BxPC3細胞S100A6 mRNA和蛋白表達的變化

注：與脂質體組比較，aP<0.01；S100A6-siRNA組間比較，bP<0.01

二、S100A6-siRNA對BxPC3細胞侵襲力的影響

培養48 h后，對照組、脂質體組及3.125、6.25、12.5 nmol/L S100A6-siRNA組的穿膜細胞數分別為(44.5±2.2)、(43.8±2.1)、(28.6±1.6)、(15.6±1.8)、(7.6±1.5)個(圖1),S100A6-siRNA呈濃度依賴性減少穿膜細胞數量(P<0.05)。

圖1 對照組(a)和S100A6-siRNA組(b)的穿膜細胞數量

三、S100A6-siRNA對細胞MMP-9活性的影響

S100A6-siRNA組細胞的MMP-9活性較對照組顯著下降(圖2)。

圖2 對照組和S100A6-siRNA組細胞的MMP-9活性

與S100蛋白家族其他成員一樣，S100A6蛋白具有EF雙螺旋結構的氨基酸序列(手型Ca2+結合區)。當此區與Ca2+結合后，S100蛋白構象就發生改變，暴露出其與靶蛋白結合的位點，進而通過相應的靶蛋白發揮其生物學效應[6]。

本實驗以靶向S100A6的siRNA轉染胰腺癌BxPC3細胞，結果顯示轉染后細胞S100A6 mRNA和蛋白表達明顯下降，且細胞侵襲能力明顯降低，說明S100A6的下調可抑制胰腺癌細胞的惡性侵襲能力。

腫瘤侵襲和轉移過程是瘤細胞從原發瘤脫離后向周圍和(或)遠處組織侵襲和轉移的過程，涉及瘤細胞穿過細胞外基質(extra celluar matrix，ECM)、血管壁基底膜及穿出血管壁進入微環境的過程。研究發現，癌細胞侵襲轉移能力與其誘導產生蛋白酶降解ECM和基底膜的能力密切相關[7-8]。文獻報道[9-10]，MMPs在胰腺腺癌細胞的侵襲和轉移中起重要的作用。本結果顯示，S100A6-siRNA組癌細胞的MMP-9活性明顯下降，提示MMP-9參與了S100A6對胰腺癌細胞侵襲的調控。至于其內在的分子機制，尚需要進一步深入研究。

[1] Ishii A,Suzuki M,Satomi K,et al.Increased cytoplasmic S100A6 expression is associated with pulmonary adenocarcinoma progression.Pathol Int,2009,59:623-630.

[2] Luo X,Sharff KA,Chen J,et al.S100A6 expression and function in human osteosarcoma.Clin Orthop Relat Res,2008,466:2060-2070.

[3] Vimalachandran D,Greenhalf W,Thompson C,et al.High nuclear S100A6 (Calcyclin) is significantly associated with poor survival in pancreatic cancer patients.Cancer Res,2005,65:3218-3225.

[4] Ohuchida K,Mizumoto K,Ishikawa N,et al.The role of S100A6 in pancreatic cancer development and its clinical implication as a diagnostic marker and therapeutic target.Clin Cancer Res,2005,11:7785-7793.

[5] Nedjadi T,Kitteringham N,Campbell F,et al.S100A6 binds to annexin 2 in pancreatic cancer cells and promotes pancreatic cancer cell motility.Br J Cancer,2009,101:1145-1154.

[6] Salama I,Malone PS,Mihaimeed F,et al.A review of the S100 proteins in cancer.Eur J Surg Oncol,2008,34:357-364.

[7] Deryugina EI,Quigley JP.Matrix metalloproteinases and tumor metastasis.Cancer Metastasis Rev,2006,25:9-34.

[8] Duffy MJ,McGowan PM,Gallagher WM.Cancer invasion and metastasis:changing views.J Pathol,2008,214:283-293.

[9] Giannopoulos G,Pavlakis K,Parasi A,et al.The expression of matrix metalloproteinases-2 and -9 and their tissue inhibitor 2 in pancreatic ductal and ampullary carcinoma and their relation to angiogenesis and clinicopathological parameters.Anticancer Res,2008,28:1875-1881.

[10] Pryczynicz A,Guzińska-Ustymowicz K,Dymicka-Piekarska V,et al.Expression of matrix metalloproteinase 9 in pancreatic ductal carcinoma is associated with tumor metastasis formation.Folia Histochem Cytobiol,2007,45:37-40.

2010-07-05)

(本文編輯：呂芳萍)

EffectsofS100A6genesilenceoninvasionofhumanpancreaticcarcinomacell

WANGXiao-yan,ZHOUYong-jing,GONGDan-dan,XUYa-ping,XUMin,FANYu.

CancerInstitute,AffiliatedPeople′sHospital,JiangsuUniversity,Zhenjiang212002,China

FANYu,Email:yuf36@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of S100A6 gene on invasion of human pancreatic cancer cell and possible mechanism.MethodsHuman pancreatic cancer BxPC3 cell line was transfected with small interfering RNA (siRNA) targeting S1006 gene, the mRNA and protein levels of S100A6 were determined by real time RT-PCR and Western blotting respectively. The invasion ability was evaluated by Transwell chamber. The matrix metalloproteinase-2 (MMP-9) activity of cancer cells was examined by gelatin zymography.ResultsThe levels of mRNA and protein of S100A6 were greatly reduced in a dose and time dependent manner, the number of penetrating cells was greatly reduced in a dose dependent manner. The expression of S100A6 mRNA in 12.5 nmol/L of S100A6 siRNA transfected group decreased from (100±0.3)% in control group to (15.3±0.2)%; while the expression of S100A6 protein decreased from (83.2±0.18)% to (13.5±0.12)%; the number of penetrating cells decreased from 44.5±2.2 to 7.6±1.5(P<0.01). The MMP-9 activity of siRNA group reduced significantly.ConclusionsS100A6 siRNA can inhibit the invasion of pancreatic cancer cells through down-regulation of MMP-9.

Pancreatic neoplasms； S100A6； Neoplasms invasiveness； Matrix metalloproteinases

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.010

鎮江市社會發展基金(SH2009204)

212002 江蘇鎮江，江蘇大學附屬人民醫院腫瘤研究所(王曉燕、周永靜、龔丹丹、許亞平、范鈺)；江蘇大學附屬醫院消化科(徐岷)

范鈺，Email：yuf36@sina.com