菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)組分和分子質(zhì)量測定

成蘭英 王 梅

(西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010)

菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)組分和分子質(zhì)量測定

成蘭英 王 梅

(西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010)

為研究菜籽粕中具有發(fā)泡性的蛋白質(zhì)組分，采用PAGE和SDS－PAGE分離由乙醇和硫酸銨提取的菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)，優(yōu)化分離條件，并測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。結(jié)果表明:PAGE分離蛋白質(zhì)的最適分離膠濃度和分離電壓分別是7.5%和240 V，蛋白質(zhì)樣品被分離成9～11種組分;SDS－PAGE分離蛋白質(zhì)的最適分離膠濃度和分離電壓是12%和200 V。用凝膠成像儀及其分析軟件Quantity One 4.6.7采集凝膠分離圖并作分析，通過對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)條帶作分子質(zhì)量標(biāo)記，測得蛋白質(zhì)樣品的分子質(zhì)量，為進(jìn)一步研究菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)提供重要的依據(jù)。

菜籽粕 發(fā)泡性蛋白質(zhì) 電泳 組分 分子質(zhì)量

菜籽粕是油菜籽加工副產(chǎn)品，菜籽粕中菜籽蛋白質(zhì)的含量高、加工功能特性優(yōu)良，人們更多關(guān)注其作為膳食資源、功能食品及在食品工業(yè)中的應(yīng)用開發(fā)［1－2］，它可用于蛋白飲料、肉制品添加劑、面食添加劑、天然保鮮劑和其他食品添加劑等。王立峰［3］將提取的菜籽蛋白質(zhì)與大豆蛋白質(zhì)、大米蛋白質(zhì)在起泡性和泡沫穩(wěn)定性上做比較，試驗結(jié)果表明菜籽蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性是三者中最好的。楊國燕等［4］的研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，油菜籽分離蛋白質(zhì)和油菜籽蛋白質(zhì)肽的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均較好。S.Bérot等［5］用納濾法、陽離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法等從菜籽粕中分離得到2S和12S蛋白質(zhì)，它們表現(xiàn)出很高的發(fā)泡性和泡沫穩(wěn)定性［2］。姜紹通等［6］的研究結(jié)果也顯示，菜籽清蛋白質(zhì)和球蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均較好，菜籽清蛋白質(zhì)的起泡性和起泡穩(wěn)定性優(yōu)于球蛋白。因此，菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)具有潛在的開發(fā)性和研究價值。

非變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)是在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中分離蛋白質(zhì)，它的優(yōu)點是電泳分離后蛋白質(zhì)分子的生物活性仍然保持，從而獲得有活性的蛋白質(zhì)，有利于開展蛋白質(zhì)分子的功能檢測及蛋白質(zhì)的整體研究［7］。Muratsubaki等［8］用含有藍(lán)瓊脂糖CL－6B的濃縮膠，采用PAGE分離血清蛋白，檢測到清晰的條帶。朱蕙霞等［9］也采用非變性不連續(xù)PAGE成功地分離大鼠海馬組織蛋白，得到分辨率高、條帶多而清晰的電泳圖譜。Chellan等［10］用非變性 PAGE結(jié)合超速離心法從血清中分離Lp(a)脂蛋白，最后用電洗脫凝膠片段獲得純化的Lp(a)。SDS－PAGE主要依據(jù)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量對其進(jìn)行分離［11－12］。蓋新娜等［13］、胡立明等［14］均采用SDS－PAGE提純分離蛋白質(zhì)、測定纖維素酶的分子質(zhì)量。迄今為止用PAGE小樣量分離分析天然菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)組分以及SDS－PAGE測定其分子質(zhì)量未曾有過報道。鑒于采用不同的提取方法會得到不同組分的蛋白質(zhì)［15］，從而影響產(chǎn)物的發(fā)泡性［16－17］，本試驗以菜籽粕為原料，分別用乙醇和硫酸銨在一定條件下提取具有發(fā)泡性的蛋白質(zhì)為樣品，優(yōu)化PAGE和SDS－PAGE分離菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)樣品的最適分離膠濃度和分離電壓，結(jié)合凝膠成像儀及其軟件進(jìn)行分析，并測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

油菜籽:市售，經(jīng)粉碎用石油醚脫脂得到菜籽粕。

丙烯酰胺(Acr)、N，N，N'，N'－四甲基乙二胺(TEMED)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、過硫酸銨(AP)、甘氨酸(Gly)、考馬斯亮藍(lán)R－250、溴酚藍(lán)、十二烷基磺酸鈉(SDS):均為分析純，成都科龍化工試劑廠;N，N－甲叉雙丙烯酰胺(Bis，分析純):天津科密歐化學(xué)試劑廠;瓊脂糖(電泳純):美國Sigma公司;蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品:P0061(14.4 ku到116 ku共7種純化的蛋白質(zhì)):上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

165 － 8001 Mini－ PROTEAN Tetra Cell、Chem Doc XRS凝膠成像系統(tǒng):美國Bio－Rad公司;ZD－85氣浴恒溫振蕩器:江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;100 μL微量進(jìn)樣器:上海高鴿工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

在4℃下采用優(yōu)化條件(即用1.0%的乙醇提取48 h，在 0.05 mol/L pH 7.0 的磷酸鈉鹽緩沖環(huán)境下用0.01 mol/L的硫酸銨提取36 h)提取菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)，經(jīng)透析得到蛋白質(zhì)提取液，4℃存放備用。電泳上樣之前，蛋白質(zhì)樣品以6 500 r/min高速離心10 min，取上清液加樣。

1.2.2 PAGE分離菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)

采用Bio－Rad的Mini－PROTEAN Tetra Cell做非變性不連續(xù)PAGE試驗［18］。根據(jù)表1中的配方，配制一定濃度的分離膠和3.0%的濃縮膠。先灌制分離膠約4.6 cm，待凝膠形成后再灌制濃縮膠，同時插入樣品梳。于室溫放置40 min后進(jìn)行梯度上樣。以蛋白質(zhì)樣品∶樣品稀釋液=1∶1混合樣品。電泳槽中加入電極緩沖液(甘氨酸－Tris)進(jìn)行電泳，濃縮膠段電壓150 V，分離膠段電壓探索200、220、240、260、280 V。待指示劑剛跑出凝膠下沿時，即電泳結(jié)束。仔細(xì)撥下凝膠，置于染色液［19］(0.05%考馬斯亮藍(lán)R－250∶20%乙醇∶10%冰乙酸)中，以50 ～60 r/min 振蕩染色 60 min［20］，用蒸餾水反復(fù)沖洗2～3次，將膠置于脫色液(無水乙醇∶冰乙酸∶水=1.5∶1.5∶7)中振蕩脫色，更換脫色液 1 ～2 次，直至背景清晰。

表1 不連續(xù)PAGE的凝膠配方

按照上述電泳步驟，首先固定分離電壓220 V，初步試驗7% ～10%的分離膠，確定最佳分離效果的膠凝濃度。再固定分離膠濃度為最佳值，探索200～280 V分離電壓，根據(jù)條帶的遷移距離和分離效果清晰程度來確定最佳分離電壓。

1.2.3 圖象采集及分析

混合蛋白質(zhì)樣品在適宜的PAGE電泳分離條件下，通過考馬斯亮藍(lán)染色后可區(qū)別單一的蛋白質(zhì)組分，一條藍(lán)帶對應(yīng)一種蛋白組分。借助凝膠成像分析軟件從中獲取更準(zhǔn)確的信息。試驗中用Chem Doc XRS凝膠成像儀采集凝膠圖，用Quantity One 4.6.7凝膠分析軟件去除整體背景、創(chuàng)建泳道、去除泳道背景和創(chuàng)建條帶等操作。樣品對投射光有部分吸收，圖像中被分離條帶的光密度會有差異。根據(jù)未知樣品在圖譜中的位置即遷移率不同，對所有泳道作對比分析，得到泳道上蛋白質(zhì)樣品條帶的光密度－遷移率圖，譜圖中每個峰即代表一種被分離的組分。

1.2.4 SDS－PAGE分離和分子質(zhì)量測定

SDS－PAGE［18］與 PAGE 操作步驟完全相同，僅凝膠、樣品稀釋液和電極緩沖液中加入一定量的SDS。固定分離膠段電壓220 V，初步試驗分離膠為7.5%、9.0%、10.0%、12.0% 的分離效果;再固定分離膠濃度為最佳值，探索240、220、200、180 V分離電壓，根據(jù)條帶的遷移距離和分離清晰程度來確定最適分離膠濃度和分離電壓。

SDS－PAGE分離之后，用Chem Doc XRS凝膠成像儀采集凝膠分離圖，用Quantity One 4.6.7凝膠成像分析軟件去除背景、創(chuàng)建泳道、對泳道去除背景和創(chuàng)建條帶，對蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)展開的條帶標(biāo)注其對應(yīng)的分子質(zhì)量，將樣品泳道與分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)泳道對比，得到各泳道光密度－遷移率圖，獲得與發(fā)泡性蛋白質(zhì)被分離組分相對應(yīng)的分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 PAGE分離蛋白質(zhì)條件的優(yōu)化

2.1.1 最適分離膠的確定

在相同電壓下采用 10.0%、9.0%、8.0%、7.5%、7.0%的分離膠凝膠體系對樣品進(jìn)行電泳分離，結(jié)果表明 10.0%、9.0%、8.0% 的凝膠無法將遷移率小的蛋白質(zhì)分開;7.5%和7.0%的分離膠沒有明顯的阻礙作用，7.5%的凝膠能使不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分開，而7.0%的凝膠對遷移率大的蛋白質(zhì)分離效果不理想且有拖尾現(xiàn)象。因此，7.5%的分離膠更適于分離菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)。

2.1.2 分離電壓的確定

采用 7.5%的分離膠，分別在 200、220、240、260、280 V電壓下對樣品進(jìn)行電泳分離，對應(yīng)的電泳時間分別為229、202、197、182、177 min。可見，電壓越大，電泳時間越短。當(dāng)電壓增加至280 V時，產(chǎn)生的熱量會引起凝膠溫度差異，也會導(dǎo)致相同分子在凝膠的不同部位會有不同的遷移速度，蛋白質(zhì)條帶產(chǎn)生彎曲畸變。同時，電壓過大蛋白質(zhì)組分分離時間不充分。另一方面，電壓小于200 V會引起分離時間過長，樣品擴(kuò)散量增加，容易造成拖尾現(xiàn)象，同樣致使分離效果差。試驗結(jié)果顯示，選擇240 V分離電壓的分離效果較好，既可以較快地完成電泳分離，又不會引起凝膠發(fā)生畸變。

2.2 PAGE 分離結(jié)果

2.2.1 電泳圖分析

當(dāng)采用7.5%的分離膠，分離段電壓為240 V時，PAGE分離菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)的結(jié)果如圖1。由圖1可知，由硫酸銨和乙醇提取的發(fā)泡性蛋白質(zhì)樣品經(jīng)PAGE分離后，蛋白質(zhì)條帶在位置、數(shù)目及染色的深淺上有差異，硫酸銨提取樣品的蛋白質(zhì)條帶著色深，一些蛋白質(zhì)條帶的位置與乙醇提取樣品的不同。不同上樣量對應(yīng)的泳道分離效果差別不大。

圖1 菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)的PAGE圖

2.2.2 泳道對比分析

采用Quantity One 4.6.7凝膠分析軟件對各泳道作分析，得到每個泳道上蛋白質(zhì)樣品條帶的光吸收掃描圖。譜圖中每個峰即代表一種被分離的組分，峰面積的大小代表組分的含量，不同的蛋白質(zhì)組分會有不同的遷移率。從光密度曲線可知，硫酸銨提取和乙醇提取的發(fā)泡性蛋白質(zhì)經(jīng)PAGE各分離成9種和9～11種蛋白質(zhì)組分，如圖2。

由于地域性差異，各地區(qū)人們生活習(xí)慣各不相同，各地區(qū)垃圾分類收集的程度也各不相同。中國餐廚垃圾與國外餐廚垃圾的差異較大，國內(nèi)外利用餐廚垃圾焚燒的應(yīng)用經(jīng)驗極少，不是餐廚垃圾處理的主流技術(shù)[3]。

將蛋白質(zhì)樣品上樣量為14 μL的泳道4(乙醇提取樣)和泳道5(硫酸銨提取樣)作比較，縱向分析兩種方法提取的菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)樣品中蛋白質(zhì)組分。乙醇和硫酸銨提取的菜籽粕蛋白質(zhì)經(jīng)PAGE分離，相對遷移率為0.2～0.9之間的幾種蛋白質(zhì)組分種類是完全相同，峰高低即光密度差異很大，說明兩種方法提取的菜籽粕蛋白質(zhì)樣品組分濃度不同，硫酸銨提取效果要優(yōu)于乙醇提取。對于硫酸銨提取的蛋白質(zhì)，相對遷移率為0.104處的峰寬且高，代表一種蛋白質(zhì)組分;而乙醇提取的蛋白質(zhì)，遷移率在0.1～0.2之間出現(xiàn)兩個峰，相對遷移率分別為0.092和0.154，代表兩種不同的分離組分。此外，硫酸銨提取的菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)經(jīng)PAGE分離得到一種遷移率為0.968的蛋白質(zhì)組分，這是乙醇提取樣中沒有的組分。綜上分析，采用不同方法從菜籽粕中提取所得的發(fā)泡性蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量并不完全相同，這是由于蛋白質(zhì)組分在不同提取液中的溶解性差異引起的。

圖2 泳道4和泳道5的條帶光吸收掃描圖

2.3 SDS－PAGE分離及分子質(zhì)量測定

2.3.1 SDS－PAGE 分離

根據(jù)分離效果(包括條帶分離的清晰程度和條帶間距等)，探索SDS－PAGE分離菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)的最適分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)和分離電壓各為12.0%和200 V。

2.3.2 分子質(zhì)量測定

當(dāng)采用12.0%的凝膠，分離電壓為200 V時，菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS－PAGE凝膠分離，經(jīng)凝膠成像儀掃描得到結(jié)果，如圖3。由圖3可知，用SDS－PAGE將蛋白質(zhì)樣品分離成若干條帶，當(dāng)上樣量為14 μL時，顯示的蛋白質(zhì)條帶數(shù)最完整，清晰度較好，分離效果最佳。因此，選擇上樣量為14 μL的泳道3和泳道5，以及蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品所在泳道4，用于凝膠進(jìn)一步分析。

圖3 菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)SDS－PAGE圖譜

采用凝膠分析軟件Quantity One 4.6.7分析，標(biāo)記泳道4對應(yīng)條帶的分子質(zhì)量分別為116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4 ku。對泳道 3、4 和 5 作對比分析，得其光密度－相對遷移率的關(guān)系，如圖4。由圖4可知，泳道對比分析結(jié)果顯示:乙醇提取的發(fā)泡性蛋白質(zhì)7種亞基分離組分的分子質(zhì)量分別是125.7、105.2、40.9、34.0、31.2、25.6、18.6 ku;硫酸銨提取的發(fā)泡性蛋白質(zhì)10種亞基分離組分的分子質(zhì)量分別是 174.4、122.2、65.5、54.7、45.6、40.9、34.0、31.2、29.3、22.4 ku。具有發(fā)泡性蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量主要集中在20.0～66.2 ku，凝膠背景較清晰，蛋白條帶較多。

圖4 菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)SDS－PAGE分離條帶的光吸收掃描圖

油菜籽中12S球蛋白質(zhì)平均分子質(zhì)量大約為300.0 ku［21］，在極端的 pH 和尿素溶液中完全分解為6個亞基，每個亞基是由2條多肽鏈組成(α鏈和β鏈，分子質(zhì)量大約各為30.0 ku和20.0 ku)通過二硫鍵連接。因此，12S蛋白每個亞基的分子質(zhì)量大約為50.0 ku，硫酸銨提取樣分離組分中54.7 ku可能對應(yīng)于12S球蛋白的每條亞基。2S清蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為 12.5 ～ 14.5 ku［22］，由于其分子質(zhì)量低，不在SDS－PAGE測量范圍之內(nèi)，未能顯示。從分子質(zhì)量的角度考慮，硫酸銨和乙醇提取菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)亞基中有3種組分相同，分子質(zhì)量分別是40.9、34.0、31.2 ku，其他組分并不相同。對于其他分子質(zhì)量組分的發(fā)泡性蛋白質(zhì)，此前還未曾有報道。分子質(zhì)量的測定將為進(jìn)一步開展菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)的分離及其研究提供重要依據(jù)。

3 結(jié)論

3.1 菜籽粕蛋白質(zhì)的組分復(fù)雜，功能特性優(yōu)良，具有作為各種食品添加劑的潛力。采用乙醇溶液和硫酸銨溶液提取菜籽粕發(fā)泡性蛋白質(zhì)，進(jìn)行非變性PAGE分離分析，采集圖譜并用凝膠軟件分析的系統(tǒng)研究，還未見報道。本研究通過探索最適分離膠濃度和分離電壓取得了分離效果良好的清晰條帶。結(jié)果還表明，采用不同方法從菜籽粕中提取蛋白質(zhì)的組分并不完全相同，是由于蛋白質(zhì)在不同提取液中溶解性差異引起的。因此，采用兩種方法提取蛋白質(zhì)樣品做電泳分離，對全面研究菜籽粕蛋白質(zhì)是必要的。

3.2 在PAGE分離的基礎(chǔ)上，用SDS－PAGE分離測定具有發(fā)泡性蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小。采用凝膠成像儀采集圖像，用凝膠定量分析軟件Quantity One 4.6.7軟件對凝膠圖作一系列分析，采用分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)條帶作分子質(zhì)量標(biāo)記，分析報告直接顯示蛋白質(zhì)樣品的分子質(zhì)量，減少了人工操作，一定程度上提高了分析的準(zhǔn)確性。其中亞基分子質(zhì)量約為50.0 ku的12S蛋白質(zhì)的分離先前已經(jīng)有報道，其他分子質(zhì)量組分的發(fā)泡性蛋白質(zhì)還未曾有報道。研究中對各組分進(jìn)行分子質(zhì)量的測定，具有發(fā)泡性蛋白的分子質(zhì)量主要集中在20.0～66.2 ku，這為進(jìn)一步研究菜籽粕具有發(fā)泡性蛋白質(zhì)提供重要的理論依據(jù)。

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Determination of Fractions and Molecular Weight of Rapeseed Protein with Foaming Property

Cheng Lanying Wang Mei
(School of Materials Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010)

Rapeseed proteins with foaming property extracted by ethanol and ammonium sulfate were separated by PAGE and SDS － PAGE to do researches on the fractions of protein with foaming property in rapeseed meal，the separation conditions were optimized，and relative molecular weights were determined.Results showed that the best concentration of separation gel and separation voltage were 7.5%and 240 V as for PAGE separation when 9 ～11 fractions were identified，and 12.0%and 200 V as for SDS － PAGE analysis.Then，the gel images were obtained by a gel image system and analyzed by the software Quantity One 4.6.7.Relative molecular weights were determined by the labeled corresponding bands of molecular weight standard with their own molecular weights，which would provide a significant basis for further research on rapeseed meal proteins with foaming property.

rapeseed meal，proteins with foaming property，electrophoresis，fractions，molecular weight

TS201

A

1003－0174(2011)07－0119－05

四川省教育廳重點項目(07Zd1117)，博士研究基金項目(07ZX0108)

2010－08－10

成蘭英，女，1966年出生，副教授，碩士生導(dǎo)師，遺傳學(xué)、有機化學(xué)