自主復制序列結合因子 1結合位點拷貝數對基因沉默的影響

張新民 于 群 畢 鑫 劉 楠 王浩天 成 巖 顏煒群 (吉林大學藥學院,吉林 長春 300)

抗衰老的主要目的是控制過速衰老,預防與年齡相關的疾病的發生和發展,提高人的生活質量〔1,2〕。目前,對人類生命健康危害最大的疾病是癌癥,癌癥一般是由細胞內一些基因的異常表達尤其是一些本該沉默的基因表達引起的〔3～7〕,對于基因表達沉默的機制目前還沒研究清楚。真核生物DNA與組蛋白組成核小體進而折疊形成染色質,整個染色質分為結構松散的基因轉錄表達的常染色質和高度濃縮的基因不表達異染色質。釀酒酵母作為一種模式生物解決了許多遺傳學、分子生物學等方面的難題。在釀酒酵母中,第三號染色質的 (HML以及HMR)區域形成了與高等生物異染色質相似的特性結構的染色質〔8,9〕。釀酒酵母的沉默子 HML-E和 HML-I對其第三號染色質的 HML區域基因沉默起著決定作用,該沉默子由復制起點識別復合物 (Origin Recognition Comp lex,ORC)結合位點,Rap1p(Rep resso rActivator Protein)結合位點和自主復制序列結合因子 1(Abf1)所組成,這些結合位點稱為原沉默子 (p rotosilencer)〔10〕。這些原沉默子獨自無法產生基因沉默作用,但是與沉默子相互作用下,能夠增強原沉默子或沉默子的基因沉默作用,但增加原沉默子拷貝數是否能增強基因沉默,甚至是產生基因沉默沒有相關研究。本研究用右側帶有報告基因乳清苷酸脫羧酶基因(URA3)的不同拷貝數的原沉默子 Abf1p結合位點,以及不帶任何結合位點的序列替代酵母基因組 HML區域的 HML-I沉默子后發現,Abf1p結合位點單獨存在無論拷貝數多少都無法對右側沉默基因,而在沉默子存在時,隨著 Abf1p拷貝數的增加基因沉默的能力逐漸增強。

1 材料與方法

1.1 材料 釀酒酵母菌種 YXB6〔MATa、HMRa、HMLa、ED79-113TSUP4-o、IΔ242、LEU2-GAL10-FLP1、ura3-52、ade2-1、lys1-1、his5-1、can1-100(ciro)〕,大腸桿菌 (DH5α)由本實驗室保存。DNA taq酶、蛋白胨、酵母提取物購自 Invitrogen公司,DNA T4連接酶,BstB I,Kpn I,HindⅢ,SnaB I等限制性內切酶購自 NEB公司。

1.2 質粒的構建 將釀酒酵母第三號染色質 AatⅡ和 BamH I之間 HML基因序列并插入到 pUC12 AatⅡ和 BamH I之間制成質粒 pQY253,接著將 pQY253上的 HML-I沉默子替換成 HMRE沉默子構建出 pQY254。接著在 pQY254的 EcoRV位點插入URA3制作出質粒 pXZ8。使用點突變 PCR法將 pXZ8的 HMRE的三個結合位點 ORC、Rap1、Abf1依次突變成 Kpn I、Spe I、Mfe I;kpn I、Spe I、Abf1p1p結合位點 ;Kpn I、Abf1p1p 結合位點、Abf1p1p結合位點;Abf1p1p結合位點、Abf1p1p結合位點、Abf1p1p結合位點的質粒,依次命名為 pXZ10,pXZ11,pXZ12以及pXZ13。

1.3 酵母菌種的構建以及 Southern印跡法鑒定 使用BspH I/NgoMⅣ兩個限制性內切酶酶切 pXZ10,pXZ11,pXZ12,pXZ13這四個質粒,LiAc法轉化到釀酒酵母 YXB6中,在缺失尿嘧啶合成缺陷型培養板 (-ura)上進行篩選。挑取單克隆菌落,-ura培養液培養,玻璃珠法提取基因組 DNA,使用 EcoRV以及BamHⅠ酶切 DNA,以 BglⅡ之間的 URA3基因 DNA為探針Southern印跡鑒定。最后獲得含有 0,1,2,3個 Abf1p結合位點的酵母菌種 YXZ75,YXZ79,YXZ80,YXZ81。然后再使用兩端帶有 HML-E兩側的同源序列的 KanMX基因分別替換掉上述菌種的 HML-E,采用 Southern印跡法鑒定菌種,最終依次得到不帶有 HML-E沉默子的酵母菌種 YXZ75DL,YXZ79DL,YXZ80DL,YXZ81DL。菌種構建示意圖見圖 1。

1.4 利用URA3基因檢測不同拷貝數 Abf1p結合位點的基因沉默表型 陽性克隆酵母菌 (YXZ75,YXZ79,YXZ80,YXZ81)在全合成培養基 (SC)中培養 24 h,在 96孔板對菌液進行 10倍比稀釋,分別在 SC,-ura,SC+5-氟乳清酸 (FOA)上點樣,在 30℃培養 24 h,48 h,72 h,96 h時,使用掃描儀掃描菌生長狀態。

圖 1 菌種構建示意圖

2 結 果

2.1 酵母菌種的構建以及 Southern印跡法鑒定 pXZ10,pXZ11,pXZ12以及 pXZ13經 BspH I以及 NgoMⅣ酶切后轉化酵母菌種 YXB6,如果同源重組發生在 HML-I左側,提取基因組DNA經 EcoRⅤ酶切,Southern印跡鑒定在圖譜上將看到2 384 bp,1 150 bp的兩條特異性的條帶;如果同源重組發生在HML-I右側,HML-I序列中有一個 EcoRV位點,會看到2 384 bp,982 bp兩條特異性條帶,酶切不徹底時還能在1 150 bp附近看到條帶。限制性內切酶 EcoRV消化提取基因組DNA的 EtBr膠圖譜,可以看出 DNA條帶彌散,說明消化的比較完全。Southern印跡鑒定的結果,可以看到陰性對照及所有的菌株都有兩條非特異性的條帶,這是由于該菌種為-ura3-52的突變型菌株,基因組上仍存在一份突變無功能的-ura3基因,它與野生型-ura3基因相同的序列,在陰性對照組 YXB6和轉化菌種都會存在一些非特異的條帶;1、2號菌株的 2 384 bp、1 150和982 bp處有三條特異性條帶,這說明同源重組發生在 HML-I右側 ,未能替代 HML-I。4、6、7、8、10、12、13、15、16 菌株在2 384 bp,1 150 bp的有兩條特異性條帶,說明他們是正確的陽性克隆。由于 YXZ79,YXZ80,YXZ81結果與 YXZ75相差不多,所以本文中沒有一一列出。見圖 2A～2C。

圖 2 YXZ75菌株的 Southern印跡鑒定結果

2.2 基因沉默表型的研究 URA3基因是一種在基因沉默研究中廣泛使用的報告基因,在生存環境中缺失尿嘧啶 (-ura)時,URA3可以被 pp rl1激活從而大量表達,因此-ura培養板菌體生長狀態反映了URA3基因的激活轉錄狀態,在 SC平板上尿嘧啶存在,URA3基因僅僅有少量正常表達,URA3蛋白作用于嘧啶代謝途徑,使 FOA變成一種有毒的代謝產物,引起酵母細胞死亡,因此 SC+FOA平板上反映了基因沉默的情況。無論是HML-E存在與否,SC平板上酵母的生長狀態沒有任何區別,這說明替換 HML-E以及 HML-I沉默子對酵母的正常生命活動沒有影響。在 HML-E沉默子存在的條件下,在-ura培養板上生長狀態基本沒有區別,說明原沉默子 Abf1p結合位點的拷貝數對激活水平的表達影響不大;在 SC+FOA平板上,隨著拷貝數的增加,FOA平板上酵母的生長逐漸變多,說明基因沉默逐漸增強。在 KanMX替換了 HML-E情況下,無論是在-ura還是 SC+FOA平板上,酵母的生長狀態都沒有任何區別,說明 Abf1p獨自無法對右側的基因產生沉默作用,而且增加拷貝數也不能。見圖 3。

圖 3 Abf1p結合位點基因沉默表型示意圖

3 討 論

衰老以及癌癥的發生與遺傳信息的突變、基因組的重排、表觀遺傳學的改變如 DNA的甲基化、組蛋白的乙酰化等這些染色質異常有關,這些情況除了遺傳信息突變會導致蛋白質發生變化外,基本都是基因表達量發生了變化,對于這種變化的本質目前還沒有研究清楚〔11,12〕。釀酒酵母是一種生物研究的模式生物,酵母基因組與高等生物的染色質相似分為常染色質和異染色質區域,基因不表達的異染色質 HML區域形成與沉默子密切相關,沉默子由原沉默子組成,單獨的原沉默子可以增強沉默子基因沉默的能力,延長沉默子基因沉默的范圍,但是尚未有人研究原沉默子拷貝數對基因沉默的影響。Abf1是一種DNA位點特異性結合蛋白,它結合到 5-TnnCGTnnnnnnTGAT-3特定的保守序列〔13〕。在釀酒酵母基因組的沉默配型座位,復制子,端粒 X-區域,許多基因啟動子區域等許多位置都有Abf1p結合位點的分布。Abf1p結合到這些區域的位點上直接參與許多與染色質相關的事件,例如 DNA復制,基因沉默,染色質重構,核苷酸剪切,基因的激活與抑制等〔14,15〕。本研究研究了Abf1p在基因沉默中的作用,Abf1p結合位點單獨存在時,無論拷貝數是多少,都無法對外源基因進行沉默,HML-E沉默子的存在時,Abf1p結合位點能對外源基因起沉默作用,并且隨著拷貝數的增加沉默作用增強。對于其他原沉默子如 Rap1p,ORC結合位點增加拷貝數是否能夠增強基因沉默,以及 Abf1p結合位點增強基因沉默的內在機制還需要進一步的研究。

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