對大豆異黃酮育種評價指標及檢測方法的探討

張永忠 許 晶

(東北農業大學理學院應用化學系1,哈爾濱 150030)

(教育部大豆生物學重點實驗室2,哈爾濱 150030)

對大豆異黃酮育種評價指標及檢測方法的探討

張永忠1,2許 晶1

(東北農業大學理學院應用化學系1,哈爾濱 150030)

(教育部大豆生物學重點實驗室2,哈爾濱 150030)

大豆異黃酮育種目前采用的評價指標是品種中大豆異黃酮總的含量,采用的檢測方法是高效液相色譜法(HPLC)或紫外分光光度法。化學結構決定生物活性,不同化學結構的各種大豆異黃酮單體具有不同的生物活性,生物活性作用的大小也不同。隨著科學研究的發展,這個評價指標還需要不斷完善,其檢測方法也應當能與國際研究接軌,這樣將更適合于現代科學研究的發展。簡述了大豆異黃酮育種的評價指標及檢測方法,建議分別以染料木苷類異黃酮含量和黃豆苷類異黃酮含量作為育種的評價指標,建議采用 AOAC公布的大豆異黃酮的檢測方法。

大豆異黃酮 育種 評價指標 AOAC檢測方法

大豆異黃酮具有抗乳腺癌和前列腺癌等多種重要的生理功能,所以育種專家們致力于培育富含大豆異黃酮的大豆品種。在培育高含量異黃酮大豆品種研究過程中,首先要確定評價指標和檢測方法。目前采用的評價指標是品種中大豆異黃酮總的含量,采用的檢測方法是高效液相色譜法(HPLC)或紫外分光光度法[1-2]。化學結構決定生物活性,不同化學結構的各種大豆異黃酮單體具有不同的生物活性,生物活性作用的大小也不同。只以大豆異黃酮總的含量為評價指標,不適應于現代科學研究的發展,所以目前的這個評價指標還需要完善。采用紫外分光光度法只能夠測定大豆異黃酮總的含量,不能測定各個單體的含量。采用高效液相色譜法可以測定大豆異黃酮單體的含量,國內就有應用 12種大豆異黃酮標準品進行檢測的報道[3],但其檢測方法過于繁瑣,而 12種大豆異黃酮的標準品在國內是很難購到的,分析檢測成本也比較高。即使有了 12種標準品,由于其中部分標準品不穩定,在存放過程中會自動分解而不宜再用。因此,目前的這個評價指標和檢測方法都是應當改進和完善的。

1 建議分別以染料木苷類異黃酮和黃豆苷類異黃酮含量作為育種的評價指標

天然存在的大豆異黃酮共有 12種,可以分為 3類,即黃豆苷類 (daidzin groups)、染料木苷類 (genis2 tin groups)和黃豆黃素苷類 (glycitin groups),分別以游離型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型和丙二酰基葡萄糖苷型等 4種形式存在[4-5]。3種游離型的異黃酮苷元包括黃豆苷元 (daidzein)、染料木黃酮(genistein)和黃豆黃素 (glycitein)。這 3種苷元分別與β-D-葡萄糖的苷羥基結合生成 3種葡萄糖苷形式的異黃酮,即黃豆苷 (daidzin)、染料木苷 (genis2 tin)和黃豆黃素苷 (glycitin)。3種葡萄糖苷形式的異黃酮中葡萄糖第 6位的羥基分別與乙酰基結合,則生成了 3種乙酰基葡萄糖苷型異黃酮;3種葡萄糖苷形式的異黃酮中葡萄糖第 6位的羥基分別與丙二酰基結合,則生成了 3種丙二酰基葡萄糖苷型異黃酮。

國內在大豆異黃酮研究中所用名詞術語比較混亂,不夠科學、嚴肅、規范。化學結構決定化合物的性質,也決定生物活性,其名稱應能反映出化合物的結構。本文將 genistein譯成染料木黃酮[6],這是因為 genistein是大豆異黃酮的苷元,從化學結構上看是黃酮類化合物,化學名稱為 5,7,4′-三羥基異黃酮。

染料木黃酮是大豆異黃酮的活性因子。任何物質的宏觀性質,主要是由其內在的結構決定的。同樣,染料木黃酮之所以被稱為植物雌激素,是因為與哺乳動物內源雌激素雌二醇結構相似,具有活性基團二酚羥基,其中染料木黃酮 7,4′兩個羥基間的距離幾乎等于 17β-雌二醇上 3,17位羥基間的距離。正是由于這種特殊的結構,能夠與雌激素靶細胞結合而呈現出一定的雌激素功能。染料木黃酮和17β-雌二醇化學結構見圖 1和圖 2。染料木黃酮具有多種生物活性和生理功能,美國國家癌癥研究所于 1996年已將其列入腫瘤化學預防藥物臨床發展計劃之中,主要預防目標是乳腺癌和前列腺癌[7]。國外研究每一種藥品或是生物活性因子,都明確標出其化學結構。如 2008年國外發表的部分研究論文[8-11],所研究的物質都是染料木黃酮。

黃豆苷元也是大豆異黃酮的活性因子。2010年,伯克康奈爾醫學研究所、紐約亨特學院生物系、密歇根大學醫學院、匹茲堡大學醫學院、內穆爾生物醫學研究所、羅徹斯特大學、亞拉巴馬伯明翰大學、波恩大學 (麻醉科、重癥醫科)等對黃豆苷元進行了臨床試驗研究[12],通過精氨酸酶 1啟動子調節器的化學篩選,鑒別出大豆異黃酮黃豆苷元可作為一種臨床上許可的通過非 cAMP依賴途徑來促進神經元的保護和再生作用的小分子。黃豆苷元還可穿過血 -腦屏障,不需經過預處理就能發揮作用[12]。

大豆異黃酮粉是 12種異黃酮的混合物,其中除含有大豆蛋白等普通成分外還含有大豆皂苷 (so2 yasaponin)等生物活性物質,但是應用大豆異黃酮粉進行生物活性試驗無法證明究竟是大豆異黃酮粉的活性還是大豆皂苷等化合物的生物活性。科學研究已經證明 12種大豆異黃酮中,染料木黃酮和黃豆苷元具有較高的生物活性[8-12]。染料木黃酮和黃豆苷元存在于豆制品中被人類廣泛攝入已有幾千年歷史。染料木黃酮和黃豆苷元是從含有 2 000種 FDA臨床上許可的藥物的文庫和多種具有人類長期安全食用記錄的天然化合物中篩選出來的化合物,所以有望成為安全的藥物[12]。因此培育富含染料木黃酮和黃豆苷元的大豆品種將具有重要意義。染料木黃酮和黃豆苷元各自的生物活性作用不同,分別培育出富含染料木黃酮和黃豆苷元的大豆品種可以用來作為制備不同功能的保健食品或是藥品的原料。應用這樣的原料可以節省染料木黃酮和黃豆苷元分離的成本,對于科學研究和生產實踐將更有意義。染料木苷類異黃酮包括染料木苷 (genistin)、乙酰基染料木苷 (6″-O-Acetylgenistin)、丙二酰基染料木苷(6″-O-Malonylgenistin)和染料木黃酮。染料木苷、乙酰基染料木苷和丙二酰基染料木苷經水解后都能生成染料木黃酮。黃豆苷類異黃酮包括黃豆苷(daidzin)、乙酰基黃豆苷 (6″-O-Acetyldaidzin)、丙二酰基黃豆苷 (6″-O-Malonyldaidzin)和黃豆苷元。黃豆苷類異黃酮水解最終產物都是黃豆苷元。建議育種專家分別將染料木苷類異黃酮含量和黃豆苷類異黃酮含量作為育種的評價指標,分別培育出富含染料木苷類異黃酮或黃豆苷類異黃酮的大豆品種。

2 建議采用 AOAC公布的大豆異黃酮檢測方法

美國分析化學家協會AOAC(Association ofOffi2 cialAnalytical Chemists)是一個統一的非盈利性科學組織,其在 2001年公布了大豆及大豆食品中異黃酮的測定方法[J.AOAC Int.84,1865(2001)]。

AOAC公布的大豆及大豆食品中異黃酮的測定方法分為提取、皂化和 HPLC檢測三個過程。待測試樣用甲醇的水溶液 (甲醇 ∶水 =80∶20,體積比)在65℃時提取 2 h。提取物在室溫下用氫氧化鈉溶液皂化,之后進行酸化,過濾。濾液用甲醇 -水(50∶50,體積比)進行稀釋。然后提取物離心澄清并通過液相色譜法進行分析測定。異黃酮葡萄糖苷和苷元在 C18反相柱上以甲醇 -水為流動相進行分離,在紫外 260 nm處檢測。結果通過總計異黃酮苷元和相應葡萄糖苷形式的苷元等價物 (均以苷元為單位)的含量表示。

該檢測方法并沒有應用高檔次儀器,僅采用 6種大豆異黃酮標準品,分析測定易于進行。不采用12種大豆異黃酮標準品、僅用 6種異黃酮標準品是有科學道理的。因為 3種丙二酰基類異黃酮和 3種乙酰基類異黃酮一般條件下是測不準的。大豆種子中 3種丙二酰基異黃酮葡萄糖苷具有熱不穩定性,5℃時貯存 5 d即自動水解為葡萄糖苷型異黃酮。丙二酰基葡萄糖苷型異黃酮干熱處理后分解得到乙酰基葡萄糖苷型異黃酮。例如,經過熱處理的大豆分離蛋白、組織蛋白和炒大豆等制品中的乙酰基葡萄糖苷型異黃酮含量很高,占總異黃酮含量的 30%～50%[13]。丙二酰基葡萄糖苷型異黃酮和乙酰基葡萄糖苷型異黃酮,在加熱和堿性條件下,可以去掉丙二酰基和乙酰基而轉化成葡萄糖苷型異黃酮。Coward等[14]發現,在較高的溫度下,丙二酰基染料木苷和乙酰基染料木苷可產生脫酯化作用生成丙二酸甲酯、乙酸甲酯和染料木苷;Pandjaitan等[15]在此基礎上進一步研究指出,其最佳轉化溫度為 50℃;此外,大豆異黃酮提取液在貯存過程中也會發生染料木苷衍生物向染料木苷的轉化[14],而葡萄糖苷型異黃酮比較穩定,要在強酸高溫或酶存在下,才可水解去掉葡萄糖基而轉化為苷元型異黃酮[16]。檢測異黃酮時要對大豆樣品進行處理,處理過程中丙二酰基葡萄糖苷型異黃酮含量要減少,因為脫羧生成了乙酰基葡萄糖苷型異黃酮,所以乙酰基葡萄糖苷型異黃酮含量會增加。雖然這 2類異黃酮的含量無法準確測出,但是他們在堿性條件下會生成穩定的葡萄糖苷型異黃酮。

有機化學中把酯鍵在堿性條件下水解稱為皂化。大豆異黃酮共有 12種,經皂化之后簡化成了 6種比較穩定的異黃酮。所以 AOAC提供的方法中應用了皂化技術。大豆異黃酮皂化的化學反應方程式如下:

AOAC法只用了 6種大豆異黃酮的標準品:染料木苷 (genistin)、染料木黃酮 (genistein)、黃豆苷(daidzin)、黃豆苷元 (daidzein)、黃豆黃素苷 (gly2 citin)和黃豆黃素 (glycitein)。皂化很容易完成,取適量待測樣品加 3 mL、2 mol/L的 NaOH溶液,用鋁箔封住塞和瓶頸,在室溫下震蕩錐形瓶 10 min即可。具體測定方法可參閱原文 [J.AOAC Int.84,1865(2001)]。建議大豆育種專家采用或參考 AOAC公布的大豆異黃酮檢測方法。應用該方法可以方便地測定大豆異黃酮總的含量和染料木苷類、黃豆苷類和黃豆黃素苷類異黃酮含量。如果分別以染料木苷類和黃豆苷類異黃酮為大豆異黃酮育種的評價指標,只需要染料木苷、染料木黃酮、黃豆苷和黃豆苷元 4種標準品即可。

綜上所述,染料木黃酮和黃豆苷元是大豆異黃酮的活性因子,建議大豆異黃酮育種專家分別以染料木苷類異黃酮含量和黃豆苷類異黃酮含量作為育種的評價指標;因為 AOAC公布的檢測方法不需要高檔次儀器,且僅需少量的大豆異黃酮標準品,所以建議采用AOAC公布的大豆異黃酮的檢測方法。

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Evaluation Indexes and DetectionMethods in Breeding of Soybean Isoflavones

Zhang Yongzhong1,2Xu Jing1
(College of Science,NortheastAgriculturalUniversity1,Harbin 150030)
(Key Laboratory of Soybean Biology,Ministry of Education2,Harbin 150030)

The evaluation index of the breeding of soybean isoflavones now adopted is the total isoflavone con2 tent in species,and the detection method used is high perfor mance liquid chromatography orUV spectrophotometry.Chemical structure deter mines biological activity.A variety of soy isoflavone monomers have different biological activ2 ities,and they have different strength of biological activity.W ith the development of scientific research,the evalua2 tion index and detection method also need i mprovement to be more suitable formodern scientific progress.The evalu2 ation index and detection method of the breeding of soybean isoflavones are briefly introduced in this article.Genistin and daidzin contents in soybean isoflavones are recommended as breeding evaluation indexes for the breeding,and AOAC methods should be adopted in the soybean isoflavone deter mination.

soybean isoflavones,breeding,evaluation index,AOAC detection method

TS201.1

A

1003-0174(2011)01-0044-05

863計劃(2008AA10Z331)

2010-02-01

張永忠,男,1953年出生,教授,碩士生導師,天然產物化學