紫花苜蓿中單寧的提取工藝優化及體外抗氧化作用研究

張縱圓，張 玲，彭 秧

（1.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院，新疆烏魯木齊830002；2.新疆大學應用化學研究所，新疆烏魯木齊830046）

紫花苜蓿中單寧的提取工藝優化及體外抗氧化作用研究

張縱圓1，張 玲1，彭 秧2

（1.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院，新疆烏魯木齊830002；2.新疆大學應用化學研究所，新疆烏魯木齊830046）

采用正交實驗法研究紫花苜蓿中單寧的最佳提取工藝條件，探討了乙醇濃度、乙醇中鹽酸的濃度、提取溫度及提取時間四因素對紫花苜蓿中單寧提取量的影響。確立了紫花苜蓿中單寧最佳提取條件為：鹽酸濃度2.5%，乙醇濃度70%，提取溫度50℃，提取時間5h，測得紫花苜蓿中單寧提取量為2.15mg/g。并采用鄰苯三酚自氧化體系、Feton體系對紫花苜蓿中單寧的抗氧化活性進行了研究，并同VC進行了比較。結果表明：紫花苜蓿中單寧對鄰苯三酚自氧化有抑制作用，對羥基自由基有良好的清除作用。

紫花苜蓿，單寧，提取，抗氧化活性

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科植物，又名木粟、分光草，在我國大部分地區均有栽培，是一種傳統的藥材，可清脾胃，利大小腸，下膀胱結石，益于五臟，輕身健體；全草提取物能抑制結核桿菌的生成［1］。該植物含有豐富的酚類化合物［2］，研究其生物活性成分，進行深加工，具有經濟價值及現實意義。本文研究了從紫花苜蓿中提取單寧的工藝，以期篩選出較好的提取方法，并采用鄰苯三酚自氧化體系、Feton體系對紫花苜蓿提取物的抗氧化活性進行研究，測定其抗氧化活性，其結果為紫花苜蓿提取物應用于醫藥、食品、化妝品提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫花苜蓿 采自新疆阿勒泰地區，去雜洗凈后，置于恒溫干燥箱中，60℃烘干，搗碎至60目備用；石油醚 30～60℃沸程；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、無水碳酸鈉、鎢酸鈉、磷鉬酸、無水乙醇、單寧酸（C76H52O46）均為分析純；水 自制新鮮蒸餾水；Folin-Denis顯色劑 50g鎢酸鈉，10g磷鉬酸，加入375mL蒸餾水溶解，再加入25mL 85%的磷酸，水浴回流2h，冷卻后定容至500mL棕色瓶中保存待用。

UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋 北京泰克儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；pHS-10B型酸度計 蕭山市分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫花苜蓿中單寧的提取 準確稱取烘干并粉碎的紫花苜蓿樣品，置于索氏提取器中，加入50mL石油醚（30～60℃）于50℃下回流2h，以除去樣品中脂類化合物，之后揮干樣品中的石油醚。準確稱取脫脂后的紫花苜蓿樣品10g，加入一定濃度的乙醇溶液，回流提取一定時間，趁熱過濾，用提取溶劑洗滌濾渣，合并濾液和洗液，得新疆紫花苜蓿單寧提取液。

1.2.2 單寧標準曲線的繪制 準確稱取單寧對照品10.2mg，用水溶解，定量轉入100mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，充分搖勻得0.102mg/mL標準溶液。

分別取單寧標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于6支25mL容量瓶中，分別加入3.0mL Folin-Denis顯色劑，5mL 7%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻放置20min，以未加單寧試劑的混合液作空白，測定756nm處吸光度值，以單寧濃度c為橫坐標，吸光值 A為縱坐標作圖，得標準方程 Y= 35.37815x+0.0069，相關系數R2=0.9993，線形范圍為：單寧濃度2.04～12.24mg/mL。

圖1 單寧標準曲線

1.2.3 提取方法的正交設計方案 在實驗中，由于各因素之間相互交叉影響［3］，因此為全面考慮乙醇提取法的工藝參數，確定以乙醇濃度、鹽酸濃度、提取時間、回流溫度四種因素進行正交實驗設計，以測定紫花苜蓿樣品中的單寧含量，實驗設計如表1。

表1 正交實驗因素及水平

1.2.4 樣品液的制備和測定 稱取5g脫脂后的紫花苜蓿粉末放入250mL錐形瓶中，加入一定比例的提取溶劑，置于恒溫水浴鍋中加熱回流，過濾，用提取溶劑洗滌濾渣，合并濾液和洗液，得新疆紫花苜蓿單寧提取液236mL。取此樣品液1mL置于10mL具塞試管中，然后按與標準曲線相同的方法測定提取液的吸光度，按下式計算提取量e：

式中：Y-單寧的質量濃度，mg/mL；V-原提取液體積，mL；W-提取用紫花苜蓿的質量，g；α-稀釋倍數。

根據所測定溶液的吸光度，用曲線方程計算出Y。

1.2.5 體外抗氧化活性的測定 采用鄰苯三酚自氧化法和Feton體系，并與同等條件下VC抗氧化能力進行比較。

1.2.5.1 紫花苜蓿提取物對超氧陰離子自由基的清除作用［4-5］在25℃的恒溫水浴鍋中，將pH8.2 Tris-HCl緩沖溶液和 2.5mmol/L鄰苯三酚水浴保溫20min，在25mL比色管中，加入5mL pH8.2 Tris-HCl緩沖溶液，1.00mL提取液，3.8mL溶劑，0.2mL 2.5mmol/L鄰苯三酚，搖勻，當鄰苯三酚加入一半時開始計時，記下反應啟動后第60s的A320值，之后每隔30s記錄一次直到反應啟動后第4.5min。抑制率按下式進行計算：

式中：V空：不含提取液時鄰苯三酚的自氧化速率；V樣：有提取液時的反應速率。

1.2.5.2 紫花苜蓿提取物對羥自由基的清除作用［6］

在10mL具塞試管中加入5mL 0.2mmol/L pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲溶液，1mL 0.75mmol/L FeSO4溶液和2mL樣品溶液，混勻后，加入1mL 3%H2O2啟動反應，于37℃水浴中反應60min后，在536nm處測定其吸光度A值，以同濃度的樣品溶液為對照品，按下式計算清除率：

式中：A0為不含樣品，但含有H2O2的吸光度值；A1為以蒸餾水代替H2O2的吸光度值；A2為含樣品的吸光度值。

1.2.5.3 與VC的對照實驗 按照上述的兩種方法測定其抗氧化活性，實驗條件同樣品。

2 結果與分析

2.1 正交實驗結果

依照表1設計L9（34）正交實驗，確定九組不同的實驗組合，分別得到紫花苜蓿中單寧的提取量，見表2。

從表2中的直觀分析可知，四因素對單寧提取量影響的主次順序為鹽酸濃度＞乙醇濃度＞回流溫度＞提取時間，并且最佳的提取工藝條件為：鹽酸濃度2.5%，乙醇濃度70%，提取溫度50℃，回流提取5h，即A2B3C1D2。在最佳的提取工藝條件下，通過測定得到新疆紫花苜蓿中單寧含量為2.15mg/g。

表2 正交實驗結果

2.2 體外抗氧化活性

紫花苜蓿乙醇提取物及VC溶液對超氧陰離子自由基都具有一定的清除能力，且其清除率隨著濃度的增加而提高，但當濃度增加到一定值后，清除率不再隨濃度增大而大幅度提高。在Feton體系中，紫花苜蓿提取物對·OH有較高的清除能力，且略高于相同條件下VC的清除能力，它們的清除能力與濃度有明顯的量效關系，即隨濃度增加而增加。

圖2 鄰苯三酚自氧化抑制結果

圖3 對羥自由基的清除結果

3 討論

3.1 正交實驗結果表明：新疆紫花苜蓿中含有豐富的單寧，在乙醇熱浸提取紫花苜蓿中的單寧時，鹽酸濃度是影響單寧提取量的關鍵因素，影響紫花苜蓿中單寧提取量的因素主次順序為：鹽酸濃度＞乙醇濃度＞回流溫度＞提取時間。確定了紫花苜蓿中單寧的最佳提取工藝條件為：鹽酸濃度2.5%，乙醇濃度70%，提取溫度50℃，回流提取5h。在最佳的提取工藝條件下測得紫花苜蓿中單寧含量為2.15mg/g。

3.2 樣品中脂類物質含量較高，影響吸光度值的測定，所以樣品在提取前需經石油醚或者氯仿脫脂。

3.3 紫花苜蓿中單寧具有較強的體外抗氧化活性，對鄰苯三酚自氧化有好的抑制能力，對·OH的清除能力高于VC。這表明紫花苜蓿提取物是良好的天然抗氧化劑，具有廣泛的開發前景和利用價值，值得綜合利用和加強資源開發。

［1］江蘇新醫學院.中藥大辭典（上冊）［M］.上海：上海人民出版社，1977：1305.

［2］盧成，曾昭海，張濤，等.紫花苜蓿生物活性成分研究［J］.草業科學，2005，22（9）：28-32.

［3］劉育梅，黃維南.正交實驗測定羊奶果葉及樹皮的單寧含量［J］.海峽藥學，2004，16（2）：49-50.

［4］Gurpreet K M，Sarwar A，Zoobi J.Evaluation of antioxidant activity of Cassia siamea flowers［ J］ .Journal of Ethnopharmacology，2006，108：340-348.

［5］弓曉峰，謝明勇，陳奕.黑芝麻與赤芝麻提取物的抗氧化作用比較［J］.食品科學，2006，27（4）：44-47.

［6］丁利君，周圳輝，林燕如.芒萁中黃酮物質的提取及其抗氧化研究［J］.食品科學，2006，26（8）：77-80.

Study on the optimum extraction and antioxidant activity of tannic acid in Alfalfa

ZHANG Zong-yuan1，ZHANG Ling1，PENG Yang2
（1.Xinjiang Uygur Autonomous Region Product Quality and Inspection in Academe，Urumqi 830002，China；2.Institute of Applied Chemistry，Xinjiang University，Urumqi 830046，China）

ln order to extract annic acid in Alfalfa，extraction technology of annic acid was studied by orthogonal experiment.Effects of concentration of extracting solution，content of HCl，temperature and time on annic Acid contents were investigated.Optimum extraction conditions were determined as follows：content of HCl was 2.5%，50% ethanol as the solvent，5h immerge extract at 50℃，the extraction yield of the flavonoids could reach 2.15mg/g.ln vitro antioxidative activity of the extract was evaluated by two systems，pyrogallol auto oxidation method and hydroxyl radical system，and compared with VC.The results indicated that annic acid in Alfalfa had restraining effects on pyrogallol autooxidation，and scavenging effects on hydroxyl radical.

Alfalfa；annic acid；extract；antioxidation activity

TS201.1

B

1002-0306（2011）01-0198-03

2009-02-03

張縱圓（1982-），女，碩士研究生，助工，主要從事分析檢驗工作。