UPLC/Q-TOF MS鑒定沃尼妙林在大鼠體內的代謝產物

畢言鋒，孫 雷，李 丹，汪 霞，徐士新，肖希龍

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081;2.中國農業大學動物醫學院，北京 100091)

沃尼妙林(Valnemulin，VLM)是新一代截短側耳素(pleuromutilin)類動物專用半合成抗生素，主要用于防治豬、牛、羊及家禽的支原體病和革蘭氏陽性菌感染［1-2］。目前，有關VLM的代謝研究資料還很少。EMEA研究表明VLM在大鼠、犬和豬體內代謝完全，并采用同位素標記和高效液相色譜法在大鼠血漿、肝、尿液及糞便中檢測到22種代謝產物，但相關代謝物的結構沒有鑒定［3］。

近年來，高分辨質譜儀(HRMS)已經廣泛用于藥物代謝物的篩選和鑒定［4］。隨著質譜技術的發展，HRMS(如Q-TOF MS)可以采集分子及其碎片離子的高分辨率(大于10 000)準確質量(誤差小于5 ppm)信息，有助于更準確的預測化合物元素組成和結構鑒定［5］。另外，相對于HPLC，UPLC采用顆粒更小(1.7 μm)的色譜柱填料，從而極大提高了復雜多組分樣品分析的分離度和靈敏度［6］。因此，UPLC與高分辨Q-TOF MS聯用，成為復雜生物體系中藥物代謝產物分離和鑒定的有力工具［7-10］。

本研究將利用UPLC/Q-TOF MS技術分析大鼠口服VLM后尿液的代謝指紋，對VLM的體內代謝產物進行篩選，并根據代謝產物的精確質量和MS/MS信息進行結構鑒定，討論VLM的體內代謝途徑。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜(UPLC，Waters公司);四級桿-飛行時間質譜儀(Synapt HDMS，Waters公司);大鼠代謝籠(意大利 Ugo Basile公司);沃尼妙林(含量大于95%);乙腈(色譜純，Fisher公司);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，國藥集團試劑廠)。

1.2 樣品采集及處理 Sprague-Dawley大鼠(購自北京維通利華實驗動物技術公司)，雄性，體重180～220 g。動物房溫度20～25℃，濕度50% ～60%，每天光照12 h。實驗前，大鼠在代謝籠內飼養一周，自由進食飲水，每天口服灌食 2 mL CMC-Na溶液。實驗前12 h，禁食，自由飲水。實驗中，每只大鼠按20 mg/kg體重劑量口服灌食沃尼妙林CMC-Na溶液，正常禁食飲水。分別采集給藥前(-12～0 h)及給藥后0～4 h(AT1)，4～12 h(AT2)和12～24 h(AT3)的尿液樣品，12 000 r/min離心后，-20℃冷凍保存至上機檢測。為了保證樣品不被污染，每次采樣前均對樣品容器進行清洗。

1.3 UPLC/Q-TOF MS 條件 ACQUITY HSS T3色譜柱(100 mm × 2.1 mm i.d.，1.7 μm);流速0.45 mL/min;柱溫35℃;流動相A為0.1%甲酸乙腈溶液，流動相B為0.1%甲酸水溶液;梯度洗脫程序:0～1min，5% ～25%A;1～5 min，25～32%A;5～7 min，32% ～80%A;7～9 min，95%A，9～11 min，5%A。進樣體積 2 μL。

QTOF MS采用ESI正電離掃描;毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓15 V;采用碰撞能量梯度(MSE)功能同時采集MS和MS/MS信息，低碰撞能設為4 V，高碰撞能梯度范圍設為10～20 V;離子源及脫溶劑氣溫度分別為120℃和350℃;脫溶劑化氣體流速設為650 L/h。TOF MS質量采集范圍為m/z 100至1 000 Da，樣品分析前用甲酸鈉溶液進行質量數校正。另外，采用亮氨酸-腦啡肽溶液(LE，m/z 566.2771)為Lock mass實時校正精確質量數。

1.4 數據處理 將給藥前后的大鼠尿液代謝指紋數據輸入MetaboLynx XS軟件進行處理，采用質量虧損過濾 (Mass defect filtering，MDF)技術消除內源性物質的干擾，然后，根據常見代謝途徑中藥物準確質量數的變化，篩選VLM的代謝產物。同時，利用化合物及碎片離子的精確質量數預測其元素組成，并根據代謝物的碎片離子信息及其與VLM的結構關系進行結構鑒定。

2 結果

2.1 VLM質譜行為研究 根據VLM分子離子(［M+H］+)的MS/MS精確質量信息，可以準確推測VLM分子在Q-TOF MS上碎裂途徑(圖1)。首先，VLM的［M+H］+容易斷裂分別生成質荷比(m/z)為 303.2335(C20H31O+2)的截短側耳素(pleuromutilin)母核碎片離子和 m/z 263.1432(C11H23N2O3S+)的側鏈碎片離子。母核碎片離子(m/z 303)可進一步失去一個H2O分子生成m/z 285.2230(C20H29O+)。另外，側鏈碎片離子(m/z 263)可以失去一個H2O分子生成 m/z 245.1324(C11H21N2O2S+)碎片離子，酰胺鍵和硫醚鍵斷裂分別生成 m/z 164.0738(C6H14NO2S+)和 m/z 171.1495(C9H19N2O+)碎片離子，而m/z 164可以失去NH3生成147.0480(C6H11O2S+)碎片離子。VLM分子離子及碎片離子的準確質量測量值與理論值間的誤差均小于5 ppm，說明儀器具有理想的質量準確性和分辨率，有助于準確預測代謝物的元素組成和結構鑒定。

圖1 VLM的MS/MS質譜圖及其主要碎裂途徑

2.2 VLM代謝產物鑒定 MetaboLynx XS處理結果顯示，與給藥前的空白樣品相比，在給藥后的大鼠尿液中除檢測到VLM原形藥物外，還發現了比原形加一個氧的代謝產物M1，M2和M3，以及比原形加兩個氧的代謝產物M4和M5(表1和圖2)。同時，根據M1～M5的MS/MS信息(圖3)對5種代謝產物的結構進行鑒定。

圖2 大鼠尿液(0～4h)中檢測到的VLM及其代謝產物M1～M5

表1 VLM及其主要代謝物的保留時間、準確質量、元素組成、主要碎片離子及其相關代謝過程

圖3 VLM主要代謝物(M1～M5)的MS/MS質譜圖

2.2.1 代謝物M1和M2 代謝物M1的元素組成(C31H52N2O6S)比VLM(C31H52N2O5S)多一個氧原子，推測M1為VLM的氧化或羥基化產物。M1具有碎片離子 m/z 263.1429(C11H23N2O3S+)、m/z 171.1497(C9H19N2O+)、m/z 164.0750(C6H14NO2S+)和m/z 147.0480(C6H11O2S+)，與 VLM 側鏈的特征碎片離子相同，說明M1的側鏈沒有發生變化。另外，碎片離子m/z 319.2282(C20H31O+3)比VLM的母核碎片離子的元素組成多一個氧原子，還可以連續失去兩個H2O分子分別生成碎片離子m/z 301.2180(C20H29)和 m/z 283.2072(C20H27O+)，說明VLM母核上發生了羥基化。M2的元素組成和碎片離子與M1相同，但保留時間不同，說明M1和M2都是VLM的母核羥基化代謝產物。

2.2.2 代謝物 M3 M3與 M1、M2具有相同的元素組成，但碎片離子和保留時間都不同。M3具有碎片離子 m/z 303.2332(C20H31O+2)和m/z285.2222(C20H29O+)，與VLM母核的特征碎片離子相同，說明M3的母核沒有發生轉化。另外，M3的碎片離子m/z 279.1381(C11H23N2O4S+)比VLM側鏈碎片離子(C11H23N2O3S+)多一個氧原子，同時，M3具有與 VLM相同的特征碎片離子 m/z 171.1482(C9H19N2O+)，但沒有發現VLM側鏈的碎片離子m/z 147(C6H11O2S+)，說明M3的側鏈的硫醚被氧化成亞砜。

2.2.3 代謝物M4和M5 M4和M5具有相同的元素組成(C31H52N2O7S)，比VLM(C31H52N2O5S)多兩個氧原子，說明它們是M1、M2和M3二次氧化或羥基化代謝物。M4的碎片離子 m/z 335.2206(C20H31O4+)比VLM的母核碎片離子(C20H31O2+)多兩個氧，并能連續失去三個H2O分子生成碎片離子 m/z 317.2112(C20H29O3+)、m/z 299.2006和 m/z 281.1931(C20H25O+)，說明 M4是VLM的母核二羥基化產物。M5的碎片離子有m/z 319.2257(C20H31O3+)、m/z 301.2182(C20H29O2+)和 m/z 279.1386(C11H23N2O4S+)、261.1267(C11H21N2O3S+)分別與M1和M3的特征碎片離子相同，說明M5是VLM母核羥基化且側鏈硫醚鍵氧化的代謝產物。

3 討論

圖4 不同時間點大鼠尿液中VLM及其代謝產物的相對濃度

將不同時間點樣品中VLM及其主要代謝物(M1～M5)的總峰面積歸一化為1000，并假設每種代謝物的質譜響應相同，計算VLM及其代謝物在尿液中的相對濃度(圖4)。結果表明，AT1、AT2和AT3組樣品中，未發生轉化的原型藥物約分別占VLM總殘留量的11%、5%和6%，說明VLM進入體內后代謝迅速，24 h內基本代謝完全，主要以代謝物形式排出體外，代謝途徑包括母核羥基化和側鏈硫醚鍵氧化。藥代動力學研究表明，VLM在動物體內的有效血藥濃度維持時間短，藥物消除較快［16］，這可能與VLM進入體內后迅速發生代謝有關。

體外代謝研究表明，截短側耳素類藥物泰妙菌素可以發生2β和8α-羥基化［11］。同時，EMEA的研究也發現，8α-羥基泰妙菌素也是泰妙菌素在動物體內的代謝產物，并將其確定為泰妙菌素在豬、雞體內的殘留標示物［12］。在本研究中，大鼠尿液樣品中VLM羥基化產物M1、M2和M4的分別約占VLM及代謝產物總量的50%、17%和5.8%，說明母核羥基化是VLM的主要代謝途徑。然而，僅根據液相色譜和質譜信息無法確定羥基化位置，還需要對羥基化產物分離提純后利用其他技術對進行結構確證。另外，由于亞砜的穩定性較差，因此，側鏈硫醚鍵氧化不是VLM的主要代謝途徑，M3的含量較低。根據以上的研究結果，可以預測VLM在大鼠體內可能的代謝途徑(圖5)。

圖5 VLM在大鼠體內的可能代謝途徑

本研究利用UPLC/Q-TOF MS技術發現了VLM在大鼠體內的5種主要代謝產物，并根據MS/MS準確質量信息對代謝物的結構進行了初步鑒定。結果表明，VLM在大鼠體內代謝迅速，代謝途徑包括母核羥基化和側鏈硫醚鍵氧化等。另外，母核羥基化產物(M1、M2和M4)是VLM在大鼠體內的主要代謝產物。

［1］Stipkovits L，Ripley P H，Tenk M，et al.The Efficacy of Valnemulin(Econor)in the Control of Disease Caused by Experimental Infection of Calves with Mycoplasma Bovis［J］.Research in Veterinary Science，2005，78(3):207-215.

［2］Stipkovits L，Ripley P H，Varga J，et al.Use of Valnemulin in the Control of Mycoplasma Bovis Infection Under Field Conditions［J］.Veterinary Record，2001，148(13):399-402.

［3］EMEA.Committee for Veterinary Medicinal Products.Valnemulin.Summary Report［Z］.1998.

［4］Zhu M S，Zhang H Y，Griffith H W.Drug Metabolite Profiling and Identification by High Resolution Mass Spectrometry［J］.J Biol Chem，2011.doi:10.1074/jbc.R110.200055.

［5］Ma S，Chowdhury S K，Alton K B.Application of Mass Spectrometry for Metabolite Identification［J］.Curr Drug Metab，2006，7(5):503-523.

［6］Wren S A C，Tchelitcheff P.Use of Ultra-Performance Liquid Chromatography in Pharmaceutical Development［J］.Journal of Chromatography A，2006，1119(1/2):140-146.

［7］Castro-Perez J M.Current and Future Trends in the Application of HPLC-MS to Metabolite-identification Studies［J］.Drug Discov Today，2007，12(5/6):249-256.

［8］Want E J，Coen M，Masson P，et al.Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Profiling of Bile Acid Metabolites in Biofluids:Application to Experimental Toxicology Studies［J］.Anal Chem，2010，82(12):5282-5289.

［9］Tiller P R，Yu S，Castro-Perez J，et al.High-throughput，Accurate Mass Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry on a Quadrupole Time-Of-Flight System as a‘first-Line’Approach forMetabolite Identification Studies［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2008，22(7):1053-1061.

［10］ Bi Y F，Wang X，Xu S X，et al.Metabolism of Olaquindox in Rat and Metabolites Identification in Urine and Feces using Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2011，25(7):889-898.

［11］曾東平，嚴 楚，孫永學，等.沃尼妙林在豬體內的生物利用度及藥代動力學研究［J］.中國獸醫科學，2010，40(10):1076-1079.

［12］ Lykkeberg A K，Cornett C，Halling-Sorensen B，et al.Isolation and Structural Elucidation of Tiamulin Metabolites Formed in Liver Microsomes of Pigs［J］.J Pharm Biomed Anal，2006，42(2):223-231.

［13］ EMEA.Committee for Veterinary Medicinal Products.Tiamulin.Summary Report(1)［Z］.1999.