框鏡鯉維氏氣單胞菌CY0806株OMPAⅠ基因的克隆及生物信息學分析

單曉楓，吳同壘，孟慶峰，王偉利，錢愛東

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118;2.吉林進出口檢驗檢疫局，長春 130062)

維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii，AV)隸屬于氣單胞菌屬，是一種新型的人-獸-魚共患病原菌。其不僅可以引發人的胃腸炎、腦膜炎、腹膜炎、敗血癥和外傷感染等［1-3］，還對魚蝦蟹等多種水生動物具有較強的致病力［4-7］。維氏氣單胞菌可產生多種毒力因子，如氣溶素、溶血素、外膜蛋白、粘附素和胞外蛋白酶等。其中，外膜蛋白可增強細菌的粘附作用，維持外膜結構、抵抗補體介導的血清殺傷力等，是一種重要的毒力因子;此外，外膜蛋白具有很強的抗原性，不僅可以刺激機體產生體液免疫和細胞免疫，還可以用外膜蛋白建立特異性強的免疫學檢測方法。

目前，國內有關維氏氣單胞菌的研究處于起步階段，尚未見AV外膜蛋白的研究報道，為此，本試驗以AV基因組DNA中克隆了OMPAⅠ基因，并對其序列進行Blast比對，用生物信息學軟件對其編碼蛋白的理化參數、二級結構、抗原表位等進行分析和預測，為維氏氣單胞菌基因工程疫苗的研發和特異性免疫學檢測方法的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 維氏氣單胞菌CY0806，分離自吉林某漁場養殖患病框鏡鯉，由本實驗室分離鑒定［8］;大腸桿菌DH5α，由本實驗室保存制備。

1.2 主要試劑 DL2000 Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T載體均購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、質粒小量抽提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;氣單胞菌培養基RS購自北京陸橋技術有限責任公司;其他試劑均為進口或國產分析純。

1.3 引物設計與合成 根據GenBank上發表的AV OMPAⅠ基因序列，用生物軟件 Primer Premer 5.0設計一對特異性引物:P1:5'-GACGATATCATGATGAAAATGGCTCCT-3'，P2:5'-GCGAAGCTTTTACTTCTGAACTTCTTG-3'。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 目的基因的PCR擴增 以AV CY0806細菌基因組DNA為模板，以P1、P2為上下游引物，反應體系50 μL，反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性1 min，59 ℃復性1 min，72 ℃延伸1.5 min，共34個循環;72℃延伸10 min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠分析后，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.5 目的基因的克隆與鑒定 將回收產物于pMD18-T載體連接，并轉化至DH5α感受態中，涂布于含氨芐青霉素LB固體培養基，37℃培養12-16 h，挑取單個菌落、液體LB中增菌，用質粒提取試劑盒提取質粒，并進行PCR鑒定，將陽性質粒送至寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.6 目的基因及編碼蛋白的生物信息學分析 利用 NCBI、DNAstar、MEGA4.0 等分子生物學軟件或網站，對目的基因及編碼蛋白進行分析。

2 結果

2.1 OMPAⅠ基因的克隆 以 CY0806基因組DNA為模板，經PCR擴增出與目的基因大小相符的條帶(圖1)。將擴增的OMPAⅠ基因片段純化后，與pMD18-T載體連接，經氨芐青霉素抗性篩選，陽性質粒經PCR鑒定證實目的基因已成功克隆與載體中。

圖1 AV CY0806株OMPAⅠ基因的PCR擴增

2.2 OMPAⅠ基因的序列分析與系統進化樹 經序列測定，OMPAⅠ基因全長1026 bp，編碼338個氨基酸。利用Blastn對獲得的OMPAⅠ基因序列進行同源性分析:該基因與維氏氣單胞菌AB2902300的OMPAⅠ基因同源性為93%，與其他氣單胞菌同源性大于80%，與不同菌種的OMPAⅠ基因構建的系統進化樹如圖2所示。

圖2 AV CY0806株OMPAⅠ基因的系統進化樹

2.3 OMPAⅠ基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.3.1 OMPAⅠ的分子特征 經ProtParam tool和DNAStar分析，OMPAⅠ分子量 36044.6 u，推測分子式C1602H2488N466O485S9，含有32個強堿性氨基酸(K，R)，31 個強酸性氨基酸(D，E)，130 個疏水氨基酸(A，I，L，F，W，V)，80 個極性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)，等電點7.82，半衰期為 30 h(體外哺乳動物類網狀細胞)、大于20 h(在酵母體內)及10 h(在大腸桿菌體內)，不穩定性系數25.78，屬于穩定蛋白，平均疏水值-0.189。

2.3.2 OMPAⅠ信號肽與轉膜區分析 通過SignaIP軟件分析:OMPAⅠ蛋白序列最前端的23個N-末端氨基酸殘基為信號肽序列，最佳切割位點為23-24個氨基酸(圖3);在線軟件TMHMM分析結果顯示:OMPAⅠ蛋白無跨膜區。

圖3 AV CY0806株OMPAⅠ蛋白分子信號肽預測

圖4 AV CY0806株OMPAⅠ蛋白的二級結構預測

2.3.3 OMPAⅠ蛋白的二級結構預測分析 以Gamier-Bobson方法預測OMPAⅠ蛋白的二級結構發現:α螺旋占41.5%，β折疊占39.5%，β轉角占6.34%，無規卷曲占 12.6%;而通過 Chou-Aasman方法分析發現α螺旋占38.9%，β折疊占16.7%，β 轉角占36.3%(圖 4)。

2.3.4 OMPAⅠ蛋白的B細胞抗原表位預測 綜合Kyte-Doolittle標準對OMPAⅠ蛋白親水區的預測、Emini原則對OMPAⅠ蛋白的表面暴露區的分析、Karplus-sohulz預測方案對OMPAⅠ蛋白柔性區域的預測、Chou-Aasman方案對OMPAⅠ蛋白的β轉角分析等結果預測OMPAⅠ蛋白可能B細胞抗原表位位于(圖5所示):78-80(Thr，Gly，Arg)、87-91(Arg，Thr，Glu，Ser，Gln)、126-128(Ser，Asp，Thr)、164-165(Asn，Gly)、171(Asn)、225-226(Asp，Thr)、247-250(Pro，Lys，Asp，Gly)、259-260(Asp，Arg)、264-265(Asp，Ala)、301-302(Gln，Pro)、334-337(Gly，Arg，Asn，Lys)。

圖5 蛋白親水性、柔韌性、表面暴露區和抗原指數分析

3 討論

維氏氣單胞菌廣泛分布于水、土壤等環境中，可感染人類并引發多種疾病。近年來，其致水產動物發病的報道也屢有發生。目前，國內對維氏氣單胞菌的研究相對較少，而有關毒力因子的研究則未見報道。其中，外膜蛋白作為革蘭氏陰性菌外膜中的重要蛋白成分，具有較強的免疫原性，且種類、數量也隨菌株的不同而有所差異。在國外，已有報道利用外膜蛋白建立的間接ELISA方法檢測維氏氣單胞菌，結果表明該檢測方法行之有效［9］;Vazquez-Juarez［10］以維氏氣單胞菌外膜蛋白做基因工程疫苗，對斑帶副鱸進行了免疫同時進行了保護力試驗，結果表明維氏氣單胞菌的外膜蛋白具有較高的免疫原性。本試驗針對維氏氣單胞菌OMPAⅠ吉亞尼設計一對特異性引物，對維氏氣單胞菌吉林分離株進行PCR擴增，得到與目的基因大小一致的基因片段，經序列分析，該基因序列與GenBank登錄的維氏氣單胞菌菌株AB2902300的OMPAⅠ同源性為93%，與其他氣單胞菌同源性大于80%，說明氣單胞菌屬間的OMPAⅠ有較高的同源性，但仍存在一定的種屬差異。

研究應用SignalP軟件對維氏氣單胞菌CY0806株OMPAⅠ蛋白的信號肽位置及最佳切割位點進行了預測。而信號肽的作用是負責蛋白質轉運及分泌，當前體蛋白已正確定位，切除信號肽，同時蛋白立體構象發生改變，前體蛋白變成成熟的蛋白質。因此，預測分析信號肽為維氏氣單胞菌OMPAⅠ蛋白的異源表達等后續研究奠定基礎。

為了提高預測蛋白二級結構的準確性，研究者往往采用不同的方法進行分析。本研究以二種方法預測分析了維氏氣單胞菌CY0806株OMPAⅠ蛋白的二級結構，結構表明:該蛋白α螺旋的含量相對較高，而α螺旋與β折疊由于有氫鍵的維持使蛋白不易變形，可以穩定蛋白結構［11］。因此，通過預測分析，維氏氣單胞菌CY0806株OMPAⅠ蛋白結構相對穩定。

目前，B細胞表位的預測一般綜合多種參數進行分析，以提高預測的準確性。本研究以親水性、柔韌性、表面可能性以及β轉角等預測方案綜合考慮。本試驗預測結果該蛋白可能有11處區域為B細胞表位，但若要證實仍需后續試驗進行驗證。一經證實，可利用合成肽等技術合成維氏氣單胞菌CY0806株OMPAⅠ蛋白的特異性B細胞表位的短肽，為制備維氏氣單胞菌的特異性抗體、建立檢測維氏氣單胞菌的特異性診斷方法奠定基礎。

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