GEOBACILLUS SP.A27的分離篩選及其淀粉酶酶學性質研究

王曉燕，高潤池，廖昌瓏，孟艷芬，唐湘華，李俊俊，許 波，黃遵錫，*

（1.中國農業大學水利與土木工程學院，北京100193；2.生物能源持續開發利用教育部工程研究中心，云南昆明650092；3.云南師范大學酶工程重點實驗室，云南昆明650092；4.云南師范大學生命科學學院，云南昆明650092；5.云南大學生命科學學院省工業微生物發酵工程重點實驗室，云南昆明650091）

GEOBACILLUS SP.A27的分離篩選及其淀粉酶酶學性質研究

王曉燕1，2，3，4，高潤池2，3，4，廖昌瓏1，2，3，5，孟艷芬2，3，4，唐湘華2，3，4，李俊俊2，3，4，許 波2，3，4，黃遵錫1，2，3，4，*

（1.中國農業大學水利與土木工程學院，北京100193；2.生物能源持續開發利用教育部工程研究中心，云南昆明650092；3.云南師范大學酶工程重點實驗室，云南昆明650092；4.云南師范大學生命科學學院，云南昆明650092；5.云南大學生命科學學院省工業微生物發酵工程重點實驗室，云南昆明650091）

用淀粉平板透明圈法，從分離自騰沖熱泉的高溫菌中篩選到一株產胞外淀粉酶的菌株，經16sRNA序列比對，在Genbank中與Geobacillus sp.sbs4s有99%同源性，定名為Geobacillus sp.A27。該菌最適生長溫度為60～65℃，在LB培養基上不生長，但能在以淀粉為唯一碳源的培養基上生長，并能將來自植物種子、根莖的淀粉質底物水解為以麥芽二糖為主的麥芽寡糖。Geobacillus sp.A27菌株產生的胞外α-淀粉酶最適pH5.6，最適溫度70℃。金屬離子Fe3+、Cu2+、EDTA對酶活有顯著抑制作用，推測AmyA27可能屬于金屬酶。粗酶液經飽和硫酸胺沉淀、無水乙醇沉淀、8%分離膠的SDS-PAGE電泳和蛋白質復性，確定該淀粉酶分子量為67kD。

α-淀粉酶，Geobacillus，篩選，酶學性質

α-淀粉酶廣泛地應用于淀粉加工、酒精和飼料行業，由于這些行業的特殊性，常需要淀粉酶具有耐熱特性，因此耐高溫淀粉酶的研究與開發具有非常重要的意義［1］。α-淀粉酶可從植物、動物中提取，也可由微生物發酵產生。目前工業生產上都以微生物發酵法大規模生產α-淀粉酶［2］。盡管從枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌和多種真菌中獲得了 α-淀粉酶［3］，但地衣芽孢桿菌（Bacillus Licheniformis）仍然是目前產耐高溫α-淀粉酶的主要生產菌種［4］，生產菌株較單一［5］。用于工業生產的菌株，大都是從自然環境中分離并經物理或化學誘變篩選的，但常規誘變常出現平頂效應，酶活到一定程度時難于進一步提高，因而，獲得具有更好性狀的菌種、開發新的酶種資源勢在必行。隨著極端環境生物的研究不斷深入，有許多嗜高溫極端微生物被分離出來，從這些嗜熱極端微生物中分離出來的酶具有極高的熱穩定性，具有極廣泛的應用價值［6］。從高溫環境中分離篩選酶源菌株，成為一種獲得耐高溫α-淀粉酶的有效途徑。本文用淀粉平板透明圈法，從分離自騰沖熱泉的200株耐高溫菌中，篩選出一株產胞外α-淀粉酶活力較高的菌株A27，其培養條件對淀粉有強烈依賴性。經16sRNA基因序列比對和生化及形態學分析，初步鑒定為Geobacillus屬菌株，暫定名為Geobacillus sp.A27，并對其生理生化及其淀粉酶酶學性質進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

200株耐高溫菌 實驗室保存，分離自騰沖熱泉；固體篩選培養基 可溶性淀粉2%，KNO30.1%，NaCl 0.05%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O 0.01%，瓊脂2.5%；種子培養基 蛋白胨1%，酵母粉1%，NaCl 0.5%，可溶性淀粉1%，調pH6.0；發酵培養基可溶性淀粉 2%，蛋白胨 1%，酵母粉1%，NaCl 0.5%，KH2PO40.1%，MgCl2·6H2O 0.05%，CaCl2· 2H2O 0.01%，調pH6.0；可溶性淀粉 浙江菱湖產，分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 產α-淀粉酶菌株的篩選

1.2.1.1 目標菌淀粉水解實驗及單菌落形態觀察將保存的菌種接種到液體種子培養基，65℃水浴搖瓶培養24h，在固體篩選培養基平板上畫線，65℃培養48h，加少量盧戈氏碘液顯色，挑透明圈HC值最大的單菌落（HC值=透明圈直徑/菌露直徑，HC值最大的為目標菌），在新平板上劃線分離、純化。觀察并記錄其單菌落的形狀、顏色、表面質地、菌落邊緣、透明度等特征。

1.2.1.2 菌株的最適生長溫度 挑單菌落分別在LB平板和（LB+1%可溶性淀粉）平板上，點格培養，分別置于37、50、60、65、70℃培養48h，然后描述細菌的生長狀態。

1.2.2 菌株生理生化特征的鑒定 在菌體形態觀察的基礎上進行生理生化特征的鑒定，選取一些主要的生理、生化指標進行常規鑒定。

1.2.3 菌株的16sRNA序列分析 CTAB/NaCl法提取菌株總DNA［7］，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段長度。

16S rDNA擴增：16S rDNA PCR擴增所使用的引物由TaKaRa公司合成，其序列為：

正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

反向引物：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′

16S rDNA PCR反應體系：50μL。PCR擴增條件：94℃ 變性 5min；94℃ 變性 1min，55℃ 退火1min30s，72℃延伸 2min30s，30個循環；72℃保溫20min。16S rDNA PCR產物純化：PCR產物用上海生工的Silver Beads DNA膠回收試劑盒進行純化后，送大連寶生物完成測序工作。采用 BLASTN在Genbank中進行同源性比對分析。

1.2.4 產酶菌株酶學性質研究

1.2.4.1 菌株α-淀粉酶發酵培養方法及粗酶制備用牙簽挑取少許純化菌種，接入裝有30mL種子培養基的250mL錐形瓶內，于65℃，150r/min，培養過夜，然后按20%比例轉接入裝有40mL發酵培養基的250mL錐形瓶中，置于迴轉式恒溫調速水浴鍋中進行好氧發酵，轉速150r/min，60℃發酵48h。

發酵液離心（10000r/min，10min），取上清液，硫酸胺分級沉淀，測定酶活力變化，確定淀粉酶的硫酸胺飽和度。硫酸胺沉淀純化的酶，經磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液透析，用于酶學性質研究、酶解底物分析、SDS-PAGE電泳。

1.2.4.2 酶活測定 藍值法［8］測定α-淀粉酶酶活：5mL 0.2%可溶性淀粉加2.5mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，空白以1mL蒸餾水代替可溶性淀粉，實驗設兩個平行實驗管。水浴預熱5min后加入1mL酶液，對照以1mL蒸餾水代替。準確反應5min后用5mL 0.1mol/L稀鹽酸終止。取1mL反應液加入到10mL 0.4mmol/L的稀碘液中，660nm測定吸收值。

1.2.4.3 酶活定義 70℃，pH=5.6，1mL酶液1min內水解可溶性淀粉的量（mg）為一個酶活力單位。

1.2.4.4 酶學性質分析 種子培養液接入發酵液，于65℃分別發酵24、36、48、60、72、84、96h。按照上述藍值法測定酶活力大小，確定最適發酵時間。用不同pH（3.2、3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0、8.6）緩沖液（磷酸氫二鈉-檸檬酸）配制0.2%的可溶性淀粉溶液，在相應pH測定酶活，確定最適pH；用不同pH緩沖液配制的酶液在40℃分別放置1h，然后測定剩余酶活力。用最適pH緩沖液配制0.2%的底物，在不同的溫度下（25、40、50、60、70、80、90℃）測定酶活，確定酶促反應的最適溫度；將酶液分別在（40、50、60、70、80、90℃）下保溫30min，然后測定剩余酶活力，作溫度穩定性曲線。在酶液中分別添加各種金屬離子和EDTA至反應液終濃度為1×10-2mol/L，在最適pH下，室溫下放置30min，以不加金屬離子和EDTA為對照（酶活力為100%），在最適pH和最適溫度下測定殘余酶活力，確定金屬離子及EDTA對酶活力的影響。

1.2.4.5 酶對不同淀粉底物的水解及產物分析［9］以可溶性淀粉為底物，用最適緩沖液配制成2%的溶液，取1mL酶液與1mL底物混合，在最適溫度反應5～30min，每隔5min取反應液與碘顯色，并按標準薄層層析方法檢測酶解產物。以七種來自不同作物（大米、玉米、大麥、馬鈴薯、木薯、蓮藕）的淀粉為底物，分別用最適緩沖液配制成2%的溶液，取1mL酶液與1mL底物混合，在最適溫度反應5～30min，并按標準薄層層析方法檢測酶解產物。

1.2.4.6 酶蛋白的電泳分離及酶分子量的確定 A27菌株發酵液12000r/min離心10min，棄沉淀，上清液用硫酸胺飽和沉淀，經磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液透析，等量無水乙醇沉淀，-70℃沉淀過夜。12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用pH5.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液溶解。用8%分離膠的SDS-PAGE電泳，得到酶蛋白的條帶，切下泳道凝膠條帶，用雙蒸水漂洗，再用10倍體積的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH5.6）室溫振蕩漂洗3次，每次1h。漂洗后的膠條浸入含0.5%可溶性淀粉的上述緩沖液，50℃浸育2h后，用無菌雙蒸水漂洗。置于含淀粉和氨卞青霉素（100μg/mL）的篩選平板，50℃溫育過夜。Lugo碘液顯色，檢測出有酶活的條帶，確定目的條帶的分子量。

2 結果與分析

2.1 產α-淀粉酶菌株的篩選

從保存的粗篩菌種篩選到一株透明圈HC值最大的單菌落，編號A27，經新平板上劃線分離、純化，甘油保種，-70℃保存。

2.2 菌株的最適生長溫度及淀粉水解實驗的研究

A27菌株在LB平板上不生長，而在（LB+1%可溶性淀粉）平板上生長良好，該菌需以淀粉為碳源的培養基；37、50℃不生長，70℃生長緩慢，最適生長溫度60～65℃。含淀粉培養基上測得透明圈HC=3。

2.3 菌株生理生化特征的鑒定

A27在65℃培養24h，單菌落白色，橢圓型、微隆起；表面濕潤、有光澤；菌落邊緣波浪狀、不透明。染色結果：桿菌；革蘭氏陽性、有莢膜、無芽孢。

生理、生化鑒定：硝酸鹽還原實驗陽性，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；甲基紅實驗陽性，代謝糖產生酸，使得培養基變酸；石蕊實驗強陽性，在乳糖發酵過程中產生大量的酸，出現酸凝固；V-P實驗弱陽性，在糖代謝過程中，利用葡萄糖產生少許丙酮酸；接觸酶實驗陽性，能產生過氧化氫酶。

2.4 分子分類研究A27菌株的16sRNA序列分析

CTAB/NaCl法提取菌株總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段長度大于15kb。

用細菌特異性16S rDNA引物，PCR擴增出約1.5kD的單一目的條帶（16S rDNA），經膠回收純化后，送交大連寶生物完成測序。采用 BLASTN在Genbank中進行同源性比對分析。結果表明，產α-淀粉酶菌株A27在Genbank中與Geobacillus sp. sbs4s有99%同源性，該株菌與 Geobacillus sp.sbs4s的進化關系較近，綜合形態鑒定及生理生化鑒定，初步將此株產生α-淀粉酶菌鑒定為Geobacillus sp.A27（GenBank accession number：FJ685616）。

2.5 產酶菌株A27粗酶酶學性質研究

2.5.1 發酵時間對酶活力的影響 按前述酶學性質分析方法獲得發酵時間-活力曲線（見圖1），最適發酵時間為36h。

2.5.2 酶作用的最適pH及pH對酶穩定性的影響pH-活力曲線顯示：最適pH為5.6；AmyA27能在酸性至中性的pH范圍內（pH 4.4～8.0）保持70%以上的酶活，這說明該酶可以在pH變化較大的條件下保持穩定，在酸性、中性和弱堿性環境中都能有效地水解淀粉質底物。

2.5.3 酶作用的最適溫度及溫度對酶穩定性的影響溫度-活力曲線（圖3）顯示：酶的最適反應溫度為70℃；溫度-穩定性曲線顯示（圖3）：酶活力隨著保溫溫度的升高而下降，在50～70℃之間下降緩慢，70℃以上下降明顯。

圖1 發酵時間-活力曲線

圖2 pH-活力曲線及pH穩定性曲線

圖3 溫度-活力曲線及溫度穩定性曲線

2.5.4 金屬離子及EDTA對酶活力的影響 結果顯示（圖4），金屬離子Mn2+對酶活有微弱的激活作用；Fe3+、Cu2+、EDTA對酶活有顯著抑制作用；Hg2+對酶活完全抑制；而K+、Mg2+、Ca2+、Pb2+則對酶活影響不大，證明Amy27A酶活對不同金屬離子有不同的反應，金屬螯合劑EDTA對酶活又有較強的抑制作用，推測Amy27A可能屬于金屬酶。

圖4 金屬離子及EDTA對酶活力的影響

2.6 酶對不同淀粉底物的水解及產物分析

以可溶性淀粉為底物的水解反應，結果顯示，酶解后殘余的淀粉與碘由最初的深藍色逐漸變淺到棕紅色、紫紅色，最終變為無色。

薄層層析顯示，起初淀粉的水解產物是一系列分子量大小各異的麥芽寡糖，隨著反應的進行，大分子的寡糖逐漸減少，小分子的寡糖逐漸增加，這表明其對淀粉的水解是一個漸變的內切過程。

圖5 α-淀粉酶水解產物硅膠G板薄層色譜分析

以來自大米、玉米、大麥、馬鈴薯、木薯、蓮藕的粗淀粉為底物的水解結果表明，來自植物種子、根莖的粗淀粉均能被該酶很好水解，淀粉水解的終產物主要為麥芽二糖和三糖，微量的葡萄糖、麥芽四糖、麥芽五糖，麥芽六糖等，表明該酶是一個典型的淀粉水解內切酶α-淀粉酶［10］，該酶在27A菌株以淀粉為唯一碳源的代謝過程中起重要作用。

2.7 酶蛋白的電泳分離、復性及酶分子量的確定

Lugo碘液顯色結果：分子量為67kD的條帶產生透明圈（圖6、圖7），有淀粉酶活性。推斷酶Amy27A的分子量為67kD。

圖6 A27α-淀粉酶的SDS-PAGE

圖7 分子量67kD條帶α-淀粉酶復性后，在淀粉平板上產生透明圈

3 討論

Geobacillus是2001年新命名的一類細菌，原屬Bacillus菌屬 rRNA種群第5組的嗜熱菌［11］。2001年，Nazina等經過對第5組細菌進行多層次的分類學研究后，認為它們是一組系統發育相近、生理和形態相似的細菌，可以組成新的菌屬，將該組嗜熱菌從Bacillus菌屬中分離出來，歸類為第8種系統發育群，命名為Geobacillus菌屬，并得到國際上的公認［12］。

Geobacillus中的大多數能夠在55℃以上生長。Geobacillus嗜熱菌群的16S rRNA序列具有高相似性（98.5%～99.2%）［13-14］，與此相反的是該組菌在生理、代謝方面卻表現出豐富的多樣性。與其他的嗜熱菌相比，Geobacilluss菌屬大多能降解和利用碳氫化合物，使該類菌在環境污染的生物治理方面具有潛在的利用價值而受到關注。Geobacillus caldoxylosilyticus菌株能利用多種有機金屬磷酸鹽為唯一磷源在60℃生長［15］，Geobacillus thermoleovorans Hamburg 2 在60℃能夠以萘為唯一碳源和能源生長［16］。Geobacillus thermocatenulatus在其最適生長溫度55℃能降解尼龍12（Nylon-12）［17］。Geobacilluss菌屬中還發現了能降解石油的菌株。

Geobacilluss菌屬廣泛分布于自然環境和人工生境中，從火山口、溫泉、干草堆等高溫環境、牛奶及海底淤泥中均分離到了Geobacillus菌屬的菌株［18］，它們分別具有不同的耐受高溫環境的生物酶，從中分離到能滿足工業生產所需的新酶種，成為研究的熱點。

各國學者從Geobacillus菌屬中獲得了幾十種酶學性質及分子量不等的新型α-淀粉酶。印度學者Uma Mahes等人從俄羅斯熱泉中分離到的Geobacillus thermoleovorans，所產 α-淀粉酶分子量26kDa，酶活最適溫度為100℃，并且不依賴Ca2+［19］；2008 年 Soliman， Nadia A. 從 Geobacillus stearothermophilus SAB-40中分離了能誘導胞內beta -半乳糖苷酶的alpha-淀粉酶［20］；Zouari Ayadi，D等從Geobacillus thermoleovorans US105 strain，克隆普魯蘭酶基因，并在E.coli中實現了表達，分離純化了由兩個相同的80kDa亞基構成的普魯蘭酶［21］；中國學者Dong.Y，Y.Liu等從分離自騰沖熱泉的Geobacillus sp.173和Geobacillus sp.174中獲得了具有降解生淀粉活性的淀粉酶［22］。

本文從分離自騰沖熱泉的高溫菌中篩選到的A27菌株，據其16sRNA序列分析，應歸于Geobacillus sp.菌屬。該菌最適生長溫度為60～65℃，能在以淀粉為唯一碳源的培養基上生長，并能將來自植物種子、根莖的淀粉質底物水解為以麥芽二糖為主的麥芽寡糖。初步研究表明，Geobacillus sp.A27菌株產生的胞外α-淀粉酶AmyA27最適pH5.6，最適溫度70℃，酶活對不同金屬離子有不同的反應，金屬離子Fe3+、Cu2+、EDTA對酶活有顯著抑制作用，推測AmyA27可能屬于金屬酶。酶液經無水乙醇沉淀，8%分離膠的SDS-PAGE電泳和蛋白質復性，確定該淀粉酶分子量為67kD。后續工作將對該酶的發酵條件進行優化、克隆和表達該淀粉酶基因，并對酶的應用價值進行更為深入的研究。

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Isolation of Geobacillus sp.A27 and characterization of its α-amylase

WANG Xiao-yan1，2，3，4，GAO Run-chi2，3，4，LIAO Chang-long1，2，3，5，MENG Yan-fen2，3，4，TANG Xiang-hua2，3，4，LI Jun-jun2，3，4，XU Bo2，3，4，HUANG Zun-xi1，2，3，4，*
（1.College of Water Conservancy and Civil Engineering，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy，Ministry of Education，Kunming 650092，China；3.The Key Lab of Enzymatic Engineering in Yunnan Normal University，Kunming 650092，China；4.Life Science School of Yunnan Normal University，Kunming 650092，China；5.Key Laboratory of Industrial Microbial Fermentation Engineering，Yunnan University，650091，China）

A strain with extracellular amylase was isolated by transparent circle in starch medium from Tengchong hot springs by 16sRNA sequence alignment in Genbank.lt has 99%homology with Geobacillus sp.sbs4s，and blongs to Geobacillus sp.lt can grow up in culture medium in which starch was only one carbon source but can not in completely medium LB without starch.The amylase activity on solute starch was optimal at pH5.6 and 70℃.The enzyme efficiently hydrolyzed various types of starch from plant seeds，roots and stems to yield a series of maltooligosaccharides by endo-cleavage mode.The enzyme had different reactions to varity metal ions，it was inhibited significantly by Fe3+，EDTA and Cu2+，it may belong to metal enzymes.The precipitate of the enzymes by ammonium sulfate and ethanol，67kD for amylase molecular weight was determined by 8%separation glue SDSPAGE protein electrophoresis.

α-amylase；Geobacillus sp；screening；characterization

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）01-0151-05

2009-12-07 *通訊聯系人

王曉燕（1964-），女，副教授，在讀博士生，主要從事微生物酶研究。

云南省應用基礎研究計劃重點項目（2006C0004Z）。