小鼠胃和闌尾組織中h-CD降解規律與死亡時間的相關性研究

劉 嘉，梁新華，焦 炎

（山西醫科大學法醫學院，山西太原 030001）

小鼠胃和闌尾組織中h-CD降解規律與死亡時間的相關性研究

劉 嘉，梁新華，焦 炎

（山西醫科大學法醫學院，山西太原 030001）

目的：觀察小鼠死亡后不同時間胃和闌尾組織中h-CD含量的變化，探討不同溫度條件下h-CD的降解規律與死亡時間的關系及其組織差異性。方法：選取72只健康成年昆明小鼠，采用機械性窒息致死后，隨機分為兩組，分別置于4℃冰箱和25℃人工氣候箱中，并于死后0、24、48、72、96、120 h提取胃及闌尾組織，采用免疫印記及計算機圖像分析技術檢測上述組織中h-CD的含量，應用SPSS 16.0軟件對數據進行統計學分析。結果：①h-CD的含量隨死亡時間的延長而降低，與死亡時間具有相關性；②不同溫度條件下，胃和闌尾組織中h-CD的降解速度均存在明顯差異（P＜0.05），h-CD在25℃組降解速度快于4℃組（P＜0.05）；③h-CD的降解速度在胃和闌尾組織中存在組織差異性，在闌尾組織中的降解速度較快（P＜0.05）。結論：h-CD的含量隨死亡時間延長而降低，其降解速度受環境溫度影響，溫度升高，降解速度加快，且胃和闌尾組織中h-CD的降解速度具有組織差異性，其在闌尾組織中的降解速度快于胃組織中的降解速度。

法醫病理學；重型鈣調蛋白結合蛋白；死亡時間；免疫印記

機體死亡后，發揮重要生命功能的蛋白質也會隨之發生降解。蛋白質的降解不僅受蛋白酶的作用，而且受尸體所處環境溫度的影響[1]。本實驗應用免疫印記法，觀察小鼠死亡后不同溫度條件下胃和闌尾組織中重型鈣調蛋白結合蛋白（h-CD）的降解規律，為死亡時間的推斷提供有效的法醫學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及制備

本研究選用實驗動物已獲得本校倫理委員會的同意。選取72只健康成年昆明小鼠，雌雄不限，體重（30±5）g（由山西醫科大學實驗動物中心提供）。采用機械性窒息方式致死后隨機分為低溫組和高溫組，每組36只，分別放置于4℃冰箱和25℃人工氣候箱中，再依據死亡時間將兩組分別再分為對照組、死后 24、48、72、96、120 h 組 6 個亞組，每組 6 只。

1.2 免疫印記檢測

分別稱取100 mg胃和闌尾組織，加入1 ml裂解液（RIAP）和10 μmol/L蛋白酶抑制劑（PMSF）。加入適量液氮，在研缽中充分研磨。 將組織勻漿后抽取500 μl，4℃ 12 000×g離心30 min，移取上清液測蛋白濃度后置于-80℃冰箱中備用。取20 μg蛋白樣品，在10%變性聚丙烯酰胺凝膠中垂直板電泳，80 V，20 min濃縮膠，120 V，70 min分離膠。用水平電泳槽將凝膠進行電轉移100 V，50 min，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜（購自武漢博士德生物工程有限公司）上。將含有蛋白質的硝酸纖維膜用TBST脫脂奶粉封閉，平緩搖動過夜，按1∶300加入caldesmon單克隆抗體（購自武漢博士德生物工程有限公司），室溫下 1 h，TBST 洗膜 10 min×3 次，按 1∶400 分別加入二抗，室溫下1 h，TBST洗膜10 min×3次。然后分別加入等體積發光劑（購自北京普利來基因有限公司）和增強劑反應1 min，分別對二者進行檢測后，柯達（KODAK Image station 440）全自動顯影系統顯像。免疫印跡法結果進行圖像掃描后采用Image proplus 5.0測出各條帶的積分光密度值（integrate optical density，IOD）。 實驗數據用均數±標準差（±s）表示。應用SPSS 16.0軟件對數據進行t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Western-blot檢測可見，存放于4℃和25℃溫度條件下的小鼠胃、闌尾組織中的h-CD的含量均隨死亡時間的延長而逐漸減少（圖1、2），且變化趨勢表現出一定的規律性，四組條帶顏色均隨死亡時間的延長而逐漸變淺，同一時間點處，25℃條件下，胃和闌尾中h-CD的含量明顯少于4℃條件時h-CD的含量，而在溫度相同的條件下可見，h-CD在闌尾組織中的降解速度快于其在胃組織中的速度。

IOD值分析結果顯示：在α=0.05檢驗水準下，4℃條件時，對胃組織在各時間點時h-CD的含量與相鄰上一時間點時 h-CD的含量進行檢驗，t值依次 為 45.205、57.429、62.799、110.229、78.282，可得 P 值均小于 0.05，具有統計學意義；對闌尾組織進行相同的檢驗，t值依次為43.171、51.382、275.094、121.302、60.061，P 均<0.05， 差異具有統計學意義。25℃條件時，對胃組織進行相同檢驗，t值依次為9.132、15.684、59.941、63.392、51.878，P 均<0.05， 差異有統計學意義；對闌尾組織進行相同的檢驗，t值依次為115.429、187.980、178.497、83.328、55.579，P 均<0.05，差異具有統計學意義。由上述分析可知，各組中h-CD的含量均隨時間的延長而減少。見表1。各時間點h-CD含量的相對變化以死后不同時間點h-CD含量占死亡即刻含量的百分數來反應，在α=0.05檢驗水準下，4℃條件時，對胃和闌尾組織中h-CD含量百分數進行檢驗，t值依次為 6.231、13.115、70.779、65.209、31.674，P均<0.05，差異具有統計學意義；在25℃條件時檢驗 ，t 值 依 次 為 4.430、45.632、62.525、47.156、22.517，P 均 <0.05，差異具有統計學意義。對胃組織4℃組和25℃組的數據進行檢驗，t值依次為 1.173、30.356、77.813、105.650、85.777，可知除死后24 h 4℃組和25℃組數據無統計學意義 （P=0.294）外，其余P均<0.05，差異具有統計學意義；對闌尾組織中各數據進行上述檢驗，t值依次為15.570、210.634、85.413、137.843、126.440，P 均<0.05，差異具有統計學意義。分析數據可知25℃組胃和闌尾組織h-CD降解速度均高于4℃組，且在同溫度比較中闌尾組織中h-CD降解速度均高于胃組織的降解速度。見表2。

表1 小鼠死后不同時間不同溫度h-CD的IOD值（±s）Tab.1 The IOD values of h-CD of mouse in the different time and temperature(±s)

表1 小鼠死后不同時間不同溫度h-CD的IOD值（±s）Tab.1 The IOD values of h-CD of mouse in the different time and temperature(±s)

與上鄰組比較，#P＜0.05Compared with up group in the same temperature and tissue,#P＜0.05

時間（h）4℃胃闌尾25℃胃闌尾0 24 48 72 96 120 14 711.23±129.35 12 095.50±16.18#9229.50±110.68#6 509.00±17.94#4 074.50±54.44#2 046.50±30.79#14 711.23±129.35 12 095.50±16.18#9 229.50±110.68#6 509.00±17.94#4 074.50±54.44#2 046.50±30.79#14 656.00±93.52 11 627.33±750.98#7 169.83±104.94#3 965.67±60.52#1 969.17±38.06#942.50±14.07#13 903.17±37.56 9 717.00±68.97#3 914.83±25.85#2 218.17±30.73#1 262.17±4.02#672.33±22.34#

表2 小鼠死后不同時間段h-CD含量的相對變化（±s，%）Tab.2 The relative content changes of h-CD of mouse in different time and temperature(±s,%)

表2 小鼠死后不同時間段h-CD含量的相對變化（±s，%）Tab.2 The relative content changes of h-CD of mouse in different time and temperature(±s,%)

同溫度不同組織間比較，*P＜0.05；同組織不同溫度間比較，#P＜0.05Comparedwithdifferent tissuesinthe same temperature,*P＜0.05;compared with different temperature in the same tissue,#P＜0.05

時間（h）4℃胃闌尾25℃胃闌尾0 24 48 72 96 120 100 82.2%±0.8 62.7%±0.6 44.3%±0.4 27.7%±0.4 13.9%±0.2 100%78.6%±1.2*58.6%±0.2*29.5%±0.2*17.4%±0.2*12.2%±0.1*100%79.3%±5.5 48.9%±1.0#27.0%±0.4#13.4%±0.3#6.3%±0.1#100%69.9%±0.6*#28.2%±0.2*#15.9%±0.2*#9.1%±0.1*#4.8%±0.2*#

3 討論

h-CD存在于正常平滑肌細胞和軟組織平滑肌腫瘤[2]及多種骨腫瘤中[3]，它可以起到抑制肌球蛋白Mg-ATP酶活性的作用，還可以抑制平滑肌磷酸化肌球蛋白所引發的肌動蛋白絲的移動[4-6]，是一種重要的調節蛋白。有研究表明，機體死亡后96 h內h-CD的含量仍保持相對穩定[7]，因此可選其作為早期死亡時間推斷的測量指標。

從本實驗可以看出在胃和闌尾組織中h-CD的含量隨死亡時間的延長而降低，與死亡時間具有相關性；在不同溫度條件下，h-CD 的含量變化存在差異（P＜0.05），h-CD 在25℃組中的降解速度快于4℃組；且h-CD的降解速度在胃和闌尾組織中也存在差異（P＜0.05），在闌尾組織中的降解速度較快。這主要是由于在機體死亡后，由于細胞膜滲透能力的變化，使得離子能自由的出入細胞。從細胞外環境、內質網、肌質網釋放出來的游離Ca2+進入了細胞液是死后發生細胞或分子水平發生變化的重要原因之一[8-9]。Ca2+進入細胞引起一系列后果：①激活鈣調蛋白。隨著死亡時間的逐漸延長，大量鈣調蛋白被進入細胞液的游離Ca2+激活，從而使作為靶蛋白的鈣調蛋白結合蛋白由于與被活化的鈣調蛋白結合[10]，其含量則逐漸下降。②激活依賴Ca2+的蛋白激酶，例如鈣蛋白酶[11]，它作用于鈣調蛋白結合蛋白后，可以根據酶解物的特異性確定鈣調蛋白結合蛋白的亞型。由于死后大量的鈣蛋白酶被激活，導致大量的鈣調蛋白結合蛋白被酶解，因此在一定時間內，隨著死亡時間的延長，由于依賴Ca2+的蛋白激酶被大量活化，鈣調蛋白結合蛋白的含量逐漸下降。以上說明，死后細胞液游離Ca2+的增加導致了鈣調蛋白和依賴Ca2+的蛋白激酶的激活，最終引起h-CD發生降解而含量減少，且隨著死亡時間的延長，機體組織的pH值逐漸降低[12]，鈣蛋白酶活性下降而溶酶體釋放的蛋白水解酶（最適pH值3～7）活性增強[13]。由于鈣蛋白酶和死亡后期溶酶體釋放的蛋白水解酶的激活，使得鈣調蛋白結合蛋白發生了蛋白水解作用而降解。因此在本實驗中，通過免疫印記法檢測可以看到隨著時間的延長，h-CD的含量逐漸降低。

在4℃組和25℃組的比較中還可發現，高溫組中h-CD的降解程度高于低溫組，這說明高溫可以加快蛋白質的分解而低溫則可起到延遲分解的作用[14-15]。這主要是因為機體死后，組織、細胞的自溶主要是在其自身固有的各種酶的作用下進行的，而酶活性的高低很大程度上受溫度的調控。因此在高溫環境下，組織、細胞結構破壞、溶解要早于低溫環境。在相同溫度條件下，腸組織自溶發生早于胃組織，其中以回盲部附近為最早，而胃體部自溶較晚[16]。從本實驗也可發現，在同組比較中，h-CD在闌尾組織中的降解速度快于在胃組織的降解速度，這與尸體腐敗的一般順序相一致。此外，影響蛋白質分解的另一重要因素是腐敗菌的作用。由于其在胃中分布很少，故而在相同溫度條件下，闌尾組織中h-CD降解速度更快。以上的實驗結果證實了h-CD的講解規律與死亡時間及溫度存在有相關性；但由于人與動物間存在種屬差異以及h-CD降解過程中受多重內、外因的影響，因此要明確h-CD在人體中的降解規律則有待于今后大量人體實驗的研究。此研究成果將對法醫學鑒定中死亡時間的認定有很大幫助。

[1]Archer MS.Rainfall and temperature effects on the decomposition rate of exposed neonatal remains[J].Sci Justice,2004,44(1):35-41.

[2]Watanabe K,Kusakabe T,Hoshi N,et al.h-Caldesmon in leiomyosarcoma and tumors with smooth muscle cell-like differentiation:its specific expression in the smooth muscle cell tumor[J].Hum Pathol,1999,30:392-396.

[3]Kazuo Watanabe,Takahiro Tajino,Miho Sekiguchi,et al.H-Caldesmon as a specific maker for smooth muscle tumors comparison with other smooth muscle makers in bone tumors [J].Am J Clin Pathol,2000,113:663-668.

[4]Gerthoffer WT,Pohl J.Caldesmon and calponin phosphorylation in regulation of smooth muscle contraction[J].Can J Physiol Pharmacol,1994,72:1410-1415.

[5] Phillips SV,Sconwoo GC,Walsh MP,et al.Comparison of the caldesmon content of cardiac and smooth muscle[J].J Mol Cell Cardiol,1999,31:1413-1417.

[6]Savineau JP,Marthan R.Modulation of the calcium sensiuvity of the smooth muscle contractile apparatus;molecular mechanisms,pharmacological and pathophysiological implication [J].Fundam Clin Pharmacol,1997,11:289-299.

[7]Kang S,Kassam N,Gauthier ML,et al.Post-mortem changes in calmodulin binding proteins in muscle and lung [J].Forensic Sci Int,2003,131(2-3):140-147.

[8]Lametsch R,Roepstorff P,Bendixen E.Identification of protein degradation during post-mortem storage of pig meat[J].J Agric Food Chem,2002,50(20):5508-5512.

[9]Kent MP,Spencer MJ,Koohmaraie M.Postmortem proteolysis is reduced in transgenic mice overexpressing calpastatin [J].J Anim Sci,2004,82(3):794-801.

[10]Obata K,Nagata K.Overexpression of calmodulin induces cardiac hypertrophy by a calcineurin-dependent pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,26:1-18.

[11]Wang KK,Villalobo A,Roufogalis BD.Calmodulin-binding proteins as calpain substrates[J].Biochem,1989,262(3):693-706.

[12]黨永輝,王振原,張聯合,等.測量大鼠死后骨骼肌pH值推斷早期死亡時間實驗研究[J].中國法醫學雜志,2005,20(4):202-205.

[13]Takeichi S,Tokunaga I.Mechanism of postmortem autolysis of skeletal muscle[J].Biochem Med,1984,32(3):341-348.

[14]Prieto JI,Magana C,et al.Interpretation of postmortem change in cadavers in Spain[J].J Forensic Sci,2004,49(5):918-923.

[15]Archer MS.Rainfall and temperature effects on the decomposition rate of exposed neonatal remains[J].Sci Justice,2004,44(1):35-41.

[16]陳新山.死后變化[A].趙子琴.法醫病理學[M].3版.北京:人民衛生出版社,2004:48-49.

Associativity study between h-CD degradation regularity and the estimation of postmortem interval in stomach and appendix of mice

LIU Jia,LIANG Xinhua,JIAO Yan
(Faculty of Forensic Medicine of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)

Objective:To observe the postmortem degradation of high molecular-weight caldesmon(h-CD)in stomach and appendix smooth muscle cells of mice,study the effects of postmortem intervals,and ambient temperature on the h-CD degradation of mice,and the variability of the h-CD degradation in stomach smooth muscle cells and appendix smooth muscle cells in different ambient temperature.Methods:72 healthy adult Kunming mice were killed by asphyxia,and put them in 4℃ refrigerator and 25℃ artificial climate incubator respectively,then extractd the stomach and appendix tissues at 0,24,48,72,96,120 h after dead.The h-CD contents in the above tissues were quantitated by western-blot assay and collected by Image Pro Plus 5.0 image analysis system,then the datas were statistically analyzed with the SPSS 16.0 software.Results:①h-CD content in stomach and appendix tissues decreased with the postmortem intervals,there was correlation between the postmortem degradation of h-CD and the postmortem intervals;②The differences of the postmortem degradation of h-CD in different ambient temperature were significant(P＜0.05),the degradation in 25℃ faster than that in 4℃;③The differences of the postmortem degradation of h-CD between stomach and appendix tissues were significant(P＜0.05),the degradation in the appendix more faster.Conclusion:h-CD content in stomach and appendix tissues decreased gradually with the postmortem intervals,the postmortem degradation of h-CD is influenced by ambient temperature,and the degradation rate tends to be raised with higher temperature,and the differences of the postmortem degradation of h-CD between stomach and appendix tissues are significant,the degradation in the appendix more faster.

Forensic pathology;High molecular-weight caldesmon(h-CD);Postmortem intervals(PMI);Western-blot

D919.4

A

1673-7210（2011）02（c）-017-03

2010-12-16）