氫過(guò)氧化物裂解酶合成己烯醛反應(yīng)的研究

陳 晨，華欲飛，孔祥珍，張彩猛

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122)

氫過(guò)氧化物裂解酶合成己烯醛反應(yīng)的研究

陳 晨，華欲飛*，孔祥珍，張彩猛

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122)

以莧菜作為氫過(guò)氧化物裂解酶(HPL)的酶源，研究了氫過(guò)氧化物裂解酶合成己烯醛的反應(yīng)，并通過(guò)頂空-氣相聯(lián)用法(HS-GC)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。該反應(yīng)中HPL對(duì)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的吸附作用，大大影響了產(chǎn)物測(cè)量的準(zhǔn)確度。通過(guò)一個(gè)校正方法來(lái)減少誤差，并在此基礎(chǔ)上考察了該反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間、pH、溫度、底物濃度、酶濃度、BHT濃度等因素對(duì)己烯醛產(chǎn)率的影響，其中當(dāng)反應(yīng)時(shí)間10min，pH7.5，溫度20℃，40mmol/L底物，酶濃度為12U/mL，BHT濃度為1mmol/L時(shí)，己烯醛的產(chǎn)率達(dá)到985mg/L。

氫過(guò)氧化物裂解酶，己烯醛，吸附作用，酶催化

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

亞麻酸 工業(yè)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%)，河北欣奇典生物科技有限公司;硼酸、四硼酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水乙醚、無(wú)水硫酸鎂、硫酸、硫酸銨、無(wú)水乙醇、tritonX-100等試劑 均為分析純;二硫蘇糖醇(DTT)、己烯醛(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)Sigma;LOX本實(shí)驗(yàn)室制備;新鮮莧菜 購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

圖1 LOX/HPL途徑降解不飽和脂肪酸生成芳香物質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞麻酸氫過(guò)氧化物的制備［5］亞麻酸氫過(guò)氧化物通過(guò)LOX氧化亞麻酸制備。稱取一定量的亞麻酸加入pH9.0硼酸鹽緩沖液中，在4℃下攪拌充分后再加入LOX并通氧氣進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)生成的氫過(guò)氧化物具有共軛雙鍵，在234nm處有特征吸收峰，因此在反應(yīng)過(guò)程中測(cè)234nm處的吸光度值，當(dāng)吸光度不再隨反應(yīng)時(shí)間增加時(shí)，反應(yīng)結(jié)束。置于4℃下冷藏待用。

1.2.2 HPL粗酶的提取 取莧菜葉(100g)加入300mL勻漿液(0.1mol/L Tris-HCl，0.5%PVP-K30，pH 8.5)組織搗碎后過(guò)濾，濾液冷凍離心后取沉淀，用含有 0.5%tritonX-100(w/v)的磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L，pH6.8，1mmol/LDTT)溶解1h，10000r/min冷凍離心30min。取上清液置4℃下待用。

1.2.3 HPL酶活的測(cè)定 亞麻酸氫過(guò)氧化物具有共軛雙鍵，在234nm處有紫外特征吸收峰而己烯醛不具備此特征，隨著底物的裂解，其共軛雙鍵被破壞，在234nm的紫外吸光度也隨之下降。摩爾吸光系數(shù)為:ε=25000cm-1M-1［6］。1U酶活定義為:在25℃，pH6.0條件下，在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol底物的酶量。

1.2.4 氫過(guò)氧化物裂解反應(yīng) 亞麻酸氫過(guò)氧化物在HPL的作用下生成己烯醛。反應(yīng)在密封的頂空瓶中進(jìn)行，反應(yīng)后直接頂空氣相法檢測(cè)，以減少產(chǎn)物損失。底物除去溶劑后加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中，然后加入HPL于恒溫振蕩水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)終體積為5mL。反應(yīng)結(jié)束后加H2SO4調(diào)酸終止反應(yīng)。

1.2.5 HPL粗酶對(duì)產(chǎn)物吸附作用的研究 由于HPL粗酶的蛋白含量較高，對(duì)于己烯醛具有明顯的吸附作用。將己烯醛標(biāo)樣與不同濃度HPL混合，攪拌一定時(shí)間達(dá)到吸附平衡后，進(jìn)行HS-GC分析。

1.2.6 校正己烯醛含量方法 在相同條件下做兩個(gè)

式中，X-吸附率;As-空白峰面積;Aa-樣A峰面積;Ab-樣B峰面積。

表觀峰面積比吸附率即可得到實(shí)際峰面積，通過(guò)此法可基本排除吸附作用對(duì)反應(yīng)的干擾，結(jié)果更加接近真實(shí)值。

1.2.7 產(chǎn)物的檢測(cè)方法 樣品通過(guò)HS-GC檢測(cè)。將樣品置于頂空進(jìn)樣器上，在70℃下保溫10min，頂空進(jìn)樣至氣相色譜儀GC-2010，PEG-20M毛細(xì)管色譜柱(30m×0.32mm，島津，日本)，程序升溫:40℃保溫5min，10℃/min升溫至180℃，保溫5min。載氣為氮?dú)猓魉?.5mL/min，F(xiàn)ID檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為250℃。己烯醛的保留時(shí)間為14.6min附近。

樣品濃度=(樣品峰面積×標(biāo)樣濃度)/標(biāo)樣峰面積

產(chǎn)率=樣品濃度×體積反應(yīng)A和B，體積為3mL。A加入2mL緩沖液，B加入2mL己烯醛標(biāo)樣;C為空白樣(2mL己烯醛標(biāo)樣加入3mL緩沖液)。分別進(jìn)行HS-GC分析。通過(guò)公式可計(jì)算出吸附率，即產(chǎn)物被HPL粗酶吸附的百分比。

2 結(jié)果與討論

2.1 粗酶的吸附作用

由于所使用的HPL是粗酶，具有較高的蛋白含量，這些蛋白對(duì)于產(chǎn)物己烯醛具有較強(qiáng)的吸附作用。圖2為不同酶濃度對(duì)于產(chǎn)物(106mg/L己烯醛)的吸附狀況。從圖2可以看出，隨著酶濃度的提高，酶對(duì)于產(chǎn)物的吸附呈線性上升，不過(guò)當(dāng)酶濃度大于18U/mL時(shí)，吸附率增加速率逐漸趨于平緩。

圖2 不同酶濃度對(duì)產(chǎn)物的吸附狀況注:己烯醛濃度為106mg/L。

2.2 反應(yīng)時(shí)間

在前10min內(nèi)，亞麻酸氫過(guò)氧化物的轉(zhuǎn)化率迅速升高，可以得出，這段時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)是劇烈而快速的，裂解作用明顯，當(dāng)反應(yīng)10min以后時(shí)，己烯醛產(chǎn)率會(huì)迅速下降，可能是被雜酶分解所引起的。因此，在反應(yīng)進(jìn)行到10min時(shí)，迅速加酸終止反應(yīng)。

2.3 pH

pH是影響反應(yīng)的關(guān)鍵因素。當(dāng)pH在5.5～6.0之間時(shí)，HPL的酶活達(dá)到最高。但是在進(jìn)行高底物濃度反應(yīng)時(shí)，亞麻酸氫過(guò)氧化物在低pH下的溶解性較差，酶與底物之間傳質(zhì)不良，因此己烯醛產(chǎn)率較低;當(dāng)pH達(dá)到7.5附近時(shí)，亞麻酸氫過(guò)氧化物基本溶解，此時(shí)己烯醛產(chǎn)率最高，為560mg/L。隨著pH的進(jìn)一步增加，酶活迅速下降，己烯醛產(chǎn)量迅速降低。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)己烯醛產(chǎn)率的影響注:底物濃度30mmol/L，pH6.0，25℃，酶濃度為3U/mL。

圖4 pH對(duì)己烯醛產(chǎn)率的影響注:底物濃度30mmol/L，25℃，酶濃度為3U/mL，反應(yīng)時(shí)間10min。

2.4 溫度

溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響包括兩個(gè)方面:一方面當(dāng)溫度升高時(shí)，與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，反應(yīng)速度加快;另一方面，隨著溫度的升高而使酶蛋白逐步變性，反應(yīng)速度隨之下降。因此，酶促反應(yīng)的最適溫度就是這兩種過(guò)程平衡的結(jié)果。據(jù)報(bào)道，HPL酶活性的最適溫度在室溫附近。由圖5可以看出，在20℃附近時(shí)，己烯醛產(chǎn)率最高，達(dá)到640mg/L，這與酶活的最適溫度一致。

圖5 溫度對(duì)己烯醛產(chǎn)率的影響注:底物濃度30mmol/L，pH7.5，酶濃度為3U/mL，反應(yīng)時(shí)間10min。

2.5 底物濃度

由圖6可以看出，隨著底物濃度的增加，己烯醛的產(chǎn)率不斷增加，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到40mmol/L時(shí)，己烯醛產(chǎn)率達(dá)到最大值651mg/L。隨后，隨著底物濃度的增加，己烯醛產(chǎn)率逐漸下降。這表明底物可能對(duì)于HPL存在抑制作用。Matsui等人［7］提出，氫過(guò)氧化物與HPL的活性中心結(jié)合并被轉(zhuǎn)化為自由基，自由基破壞了活性中心的巰基而使酶失活，該假設(shè)尚未完全被證實(shí)。

2.6 加酶量

由圖7可以看出，隨著反應(yīng)液中酶濃度的提高，己烯醛產(chǎn)率提高，當(dāng)酶濃度達(dá)到12U/mL時(shí)，己烯醛產(chǎn)率達(dá)到最高，為901mg/L左右，進(jìn)一步增加酶濃度時(shí)，由于酶與底物結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和，高濃度的酶液的粘度偏大，影響酶與底物的充分結(jié)合，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)率略有下降。

圖6 底物濃度對(duì)己烯醛產(chǎn)率的影響注:pH7.5，20℃，加酶量分別為0.5、1、2、3、4、5、6、8U/mL，以確保酶底比一致，反應(yīng)時(shí)間10min。

圖7 加酶量對(duì)己烯醛產(chǎn)率的影響注:底物濃度40mmol，pH7.5，20℃，反應(yīng)時(shí)間10min。

2.7 BHT濃度

如圖8所示，最適的BHT濃度為1mmol/L，此時(shí)己烯醛產(chǎn)率為985mg/L。HPL反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基攻擊HPL的活性中心，進(jìn)而抑制了HPL反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，而B(niǎo)HT可能會(huì)對(duì)這些自由基具有清除作用，對(duì)于己烯醛產(chǎn)率的提高具有促進(jìn)作用。

圖8 BHT濃度對(duì)己烯醛產(chǎn)率的影響注:40mmol/L底物，pH7.5，20℃，加酶量12U/mL，反應(yīng)時(shí)間10min。

3 結(jié)論

3.1 HPL對(duì)于合成的產(chǎn)物己烯醛具有較強(qiáng)的吸附作用，酶濃度越高，吸附作用越強(qiáng)，本文提出了一個(gè)校正產(chǎn)率的方法。

3.2 HPL合成己烯醛的最佳條件為:反應(yīng)10min、pH 7.5、20℃、底物濃度40mmol/L、加酶量12U/mL、BHT 1mmol/L;在此條件下己烯醛的產(chǎn)率為985mg/L。

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Study on the synthesis of hexenal catalyzed by hydroperoxide lyase

CHEN Chen，HUA Yu-fei*，KONG Xiang-zhen，ZHANG Cai-meng
(State Key Laborary of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Amaranth was used as resource material of hydroperoxide lyase(HPL).Synthesis of hexenal with hydroperoxide(13-HPOT)catalyzed by hydroperoxide lyase was studied，the method of HS-GC was taken to analyze the product.The crude enzyme had a strong adsorption effect on the product influencing the accuracy of result.A method was found to revise the amount of product.On the basis of this analytical method’s improvement，the reaction was explored.The optimal condition was:10min reaction time，pH 7.5，20℃，40mmol/L concentration of substrate，12U/mL HPL concentration，1mmol/L BHT concentration.The yield of hexenal achieved 985mg/L.

hydroperoxide lyase;hexenal;adsorption effect;enzymatic catalysis

TS201.2

B

1002-0306(2011)11-0296-04

綠色植物所特有的清香香氣的主要成分是C6醛類和酮類，如己醛、己烯醛等化合物。這些物質(zhì)在植物組織受傷，或者受到昆蟲(chóng)和細(xì)菌侵害時(shí)產(chǎn)生［1-2］。它們?cè)谥参矬w內(nèi)主要是通過(guò)脂肪氧合酶/氫過(guò)氧化物裂解酶(LOX/HPL)途徑生成的(見(jiàn)圖1)。多不飽和脂肪酸(PUFA)在脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)的作用下與O2結(jié)合，形成氫過(guò)氧化脂肪酸;后者又作為氫過(guò)氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase，HPL)的底物被裂解;隨著LOX和HPL特異性的不同，將分別產(chǎn)生C6、C9或C10醛［3］。植物HPL屬于細(xì)胞色素P450(CytP450)類蛋白家族，相對(duì)分子質(zhì)量為40000～60000的血紅素-鐵硫蛋白。它可以分成兩類，一種催化C18氫過(guò)氧化物生成兩個(gè)C9片段，另一種催化C18氫過(guò)氧化物生成一個(gè)C6醛和一個(gè)C12過(guò)氧酸片段。具有第一種活性的HPL在梨的果實(shí)和葉片中發(fā)現(xiàn)，具有第二種活性的HPL在西瓜苗、茶葉、番茄果實(shí)、紫花苜蓿苗、大豆以及菠菜葉中被發(fā)現(xiàn)，而黃瓜HPL同時(shí)具有兩種位置特異性［4］。將發(fā)生在植物組織內(nèi)的LOX/HPL酶聯(lián)催化過(guò)程應(yīng)用到食品風(fēng)味成分的商業(yè)化制備具有非常誘人的前景。該過(guò)程采用天然原料，在模擬植物代謝過(guò)程的條件下制備完成，根據(jù)歐洲和美國(guó)食品法規(guī)，產(chǎn)品是“天然的”。工藝過(guò)程不產(chǎn)生任何有毒、有害廢料，因此是“綠色和清潔的”。目前國(guó)外采用該法制備香料化合物取得了一定成果，但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)HPL途徑生成己烯醛的反應(yīng)進(jìn)行了初步探索，研究了該反應(yīng)的影響因素并確定其最佳反應(yīng)條件，為其工業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

2010-10-21 *通訊聯(lián)系人

陳晨(1986-)，男，在讀碩士，主要從事糧食油脂及植物蛋白方面研究工作。

國(guó)家863計(jì)劃基金(2008AA10Z305);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(JUSRP10919)。