重金屬鉛和汞對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的微核效應(yīng)

孔令芳，朱紅瓊，楊曉霞

（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

重金屬鉛和汞對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的微核效應(yīng)

孔令芳，朱紅瓊，楊曉霞*

（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

以蠶豆根尖為試材，不同濃度的醋酸鉛和氯化汞為受檢物，探討重金屬Pb2+和Hg2+對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的微核效應(yīng)。結(jié)果表明：Pb2+和Hg2+均能誘發(fā)蠶豆較高的微核率，且微核率隨溶液濃度升高而增加，但當(dāng)高于一定濃度后，微核率反而有下降的趨勢(shì)。因此，蠶豆可以作為快速檢測(cè)環(huán)境中Pb2+和Hg2+遺傳毒性的材料。

鉛離子；汞離子；蠶豆根尖細(xì)胞；微核千分率

微核試驗(yàn)是以動(dòng)植物為材料，利用細(xì)胞生物學(xué)方法通過(guò)對(duì)其微核率的觀察來(lái)表示動(dòng)植物受遺傳損傷程度的一種方法〔1〕。微核的形成是細(xì)胞受誘變劑作用后的一種遺傳學(xué)終點(diǎn)〔1-2〕。

蠶豆根尖細(xì)胞微核試驗(yàn)（micronucleustest, MC-NT）技術(shù)是一種以染色體斷裂及紡錘絲損傷為測(cè)試終點(diǎn)的植物微核檢測(cè)方法〔3〕。自Degrassi〔1〕等首先利用蠶豆根尖微核試驗(yàn)建立了誘變劑對(duì)蠶豆根尖微核監(jiān)測(cè)系統(tǒng)以來(lái)，該技術(shù)深受人們重視。此技術(shù)作為一項(xiàng)生物監(jiān)測(cè)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于水體、土壤和空氣等環(huán)境污染的監(jiān)測(cè)，并于1986年被列入國(guó)家生物監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范（水環(huán)境部分），用于監(jiān)測(cè)水體污染〔1，4-10〕。

鉛和汞是眾多重金屬中常見的兩種，其中汞是最具危險(xiǎn)性的有毒有害元素之一。其主要污染源是工業(yè)用鉛和汞的散失、燃煤中鉛和汞的排放、垃圾焚燒和汽車尾氣排放等〔11-12〕。排入生態(tài)系統(tǒng)的污染物會(huì)引起生物細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的改變，影響細(xì)胞正常的生理、生化等代謝活動(dòng)的有序進(jìn)行〔12〕。

本試驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞分裂后微核數(shù)量的計(jì)算，監(jiān)測(cè)鉛和汞對(duì)環(huán)境的污染程度，即驗(yàn)證微核測(cè)定技術(shù)及其作為一種環(huán)境致突變性的檢測(cè)手段的廣泛應(yīng)用性。

1 材料與方法

供試植物材料為云南大理市售蠶豆。用蒸餾水將分析純醋酸鉛配制成0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、500.0 mg/L、分析純氯化汞配制成0.01、0.05、0.10、1.00、3.00、6.00 mg/L各6種不同質(zhì)量濃度的溶液，蒸餾水做陰性對(duì)照。

1.1 蠶豆浸種、催芽 選取籽粒飽滿、大小一致的蠶豆種子洗凈后，放入盛有蒸餾水的大燒杯內(nèi)，浸泡約24 h，期間換水1～2次。待種子充分吸脹后，將其放入鋪有一薄層濕潤(rùn)脫脂棉的解剖盤中，置于（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)2～3 d，期間換水4～6次，使其長(zhǎng)出1.5～3.0 cm長(zhǎng)的初生根。

1.2 染毒處理 選取發(fā)育良好、根長(zhǎng)基本一致的蠶豆種子，每13～16粒一組（隨機(jī)組合），放入盛有不同質(zhì)量濃度的Pb2+和Hg2+溶液的大培養(yǎng)皿中直接染毒，被測(cè)液浸沒根尖即可。染毒處理24 h，同時(shí)選用蒸餾水作陰性對(duì)照。

1.3 修復(fù)培養(yǎng) 將處理過(guò)的種子用蒸餾水浸洗2次，每次5～10 min后，再放入新鋪好的濕潤(rùn)脫脂棉的解剖盤（或培養(yǎng)皿）內(nèi)，按前述培養(yǎng)條件使根尖細(xì)胞修復(fù)培養(yǎng)22～24 h。

1.4 材料固定 取修復(fù)培養(yǎng)后不同處理組的種子，從根尖頂端用剪刀剪下幼根1㎝左右，立即用卡諾氏固定液（3份無(wú)水乙醇加1份冰醋酸）固定24 h。將固定后的根尖換入70%乙醇溶液，置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 解離 用蒸餾水清洗固定好的幼根1～2次，每次3～5 min后吸凈蒸餾水，用1 mol/L的鹽酸在50℃恒溫水浴中解離5～20 min，至幼根軟化即可。

1.6 染色和制片 將解離后的根尖吸去鹽酸，用蒸餾水漂洗數(shù)次后置于載玻片上，從根冠起切取根尖1～1.5 mm的分生組織，將其搗碎，加1～2滴Gi?emsa染液，染色10～15 min，蓋上蓋玻片輕輕敲打使根尖細(xì)胞分散良好。每種處理的材料各做10～14個(gè)根尖壓片。

1.7 鏡檢 制好的壓片置于顯微鏡下檢查，選擇其中細(xì)胞較分散，染色效果明顯的6個(gè)壓片進(jìn)行計(jì)數(shù)。在40×10倍顯微鏡下觀察，選其根尖分生區(qū)良好的區(qū)域并統(tǒng)計(jì)不少于1 000個(gè)細(xì)胞中微核數(shù)，測(cè)定其微核千分率和污染指數(shù)（PI），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

微核千分率=微核數(shù)/觀察統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞總數(shù)× 1 000‰。

PI＝樣品實(shí)測(cè)微核千分率的平均值/對(duì)照組微核千分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸鉛對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核發(fā)生率的影響不同質(zhì)量濃度的醋酸鉛溶液處理后，蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂不同時(shí)期均可產(chǎn)生微核，包括單微核和雙微核（見圖1）。

圖1 重金屬Pb2+對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核的影響

表1 不同質(zhì)量濃度的Pb2+、Hg2+對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響

不同質(zhì)量濃度的Pb2+對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率及污染指數(shù)（PI）的影響見表1。

由表1可見：醋酸鉛能誘發(fā)較高頻率的微核，6個(gè)不同質(zhì)量濃度的醋酸鉛溶液所誘發(fā)的微核率與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由此可見：Pb2+對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞具有較大的遺傳毒害作用。在0.1～10.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，微核率隨醋酸鉛濃度的升高而增加，在50.0 mg/L質(zhì)量濃度時(shí)微核率最高（27.73±0.93）；當(dāng)醋酸鉛溶液濃度超過(guò)50.0 mg/L時(shí)，微核率反而下降。這可能是由于過(guò)高濃度的Pb2+溶液引起蠶豆根尖細(xì)胞的亞致死性傷害，進(jìn)而引起細(xì)胞反應(yīng)性降低，或抑制了細(xì)胞有絲分裂，甚至造成細(xì)胞的死亡，從而最終造成其細(xì)胞微核率反而下降的趨勢(shì)。

而PI的變化與微核率保持一致，總體趨勢(shì)是隨醋酸鉛濃度的升高而增加。當(dāng)醋酸鉛溶液質(zhì)量濃度在50.0 mg/L時(shí)，PI達(dá)3.82。

2.2 氯化汞對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核發(fā)生率的影響不同質(zhì)量濃度的氯化汞溶液處理后，蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂不同時(shí)期均可產(chǎn)生微核，包括單微核和雙微核（見圖2）。

圖2 重金屬Hg2+對(duì)蠶豆根尖微核的影響

不同質(zhì)量濃度的Hg2+對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率及污染指數(shù)的影響見表1。

由表1可見：氯化汞也能誘發(fā)較高頻率的微核，6個(gè)不同質(zhì)量濃度氯化汞所誘發(fā)的微核率與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由表1可知：低濃度的Hg2（+0.01 mg/L）能誘發(fā)較高的微核率，Hg2+對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞具有較大的遺傳毒害作用。在0.01～0.10 mg/L濃度范圍內(nèi)，微核率隨氯化汞質(zhì)量濃度的升高而增加，在1.00 mg/L時(shí)微核率最高（22.75±0.86）；當(dāng)氯化汞溶液的質(zhì)量濃度超過(guò)1.00 mg/L時(shí)，微核率反而下降，當(dāng)濃度為6.00 mg/L時(shí)，其微核率與對(duì)照組（蒸餾水處理）相差最小。這可能是由于過(guò)高濃度的Hg2+離子引起蠶豆根尖細(xì)胞的亞致死性傷害，進(jìn)而引起細(xì)胞反應(yīng)性降低或抑制了細(xì)胞有絲分裂，甚至造成細(xì)胞死亡，從而最終引起其細(xì)胞微核率下降。其PI的變化與微核率仍保持一致，隨氯化汞溶液質(zhì)量濃度的升高而增加。當(dāng)氯化汞溶液質(zhì)量濃度在1.00 mg/L時(shí)，PI達(dá)3.13。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞質(zhì)中的微核來(lái)源有二：一是斷片或無(wú)著絲粒染色體環(huán)在細(xì)胞分裂后期不能定向移動(dòng)，遺留在細(xì)胞質(zhì)中；二是有絲分裂的作用使個(gè)別染色體或帶著絲粒的染色體環(huán)和斷片在細(xì)胞分裂后期被留在細(xì)胞質(zhì)中〔13〕。微核率的大小可以直接表征染色體DNA受損傷程度〔14〕。通過(guò)不同濃度的醋酸鉛和氯化汞對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞誘導(dǎo)的微核效應(yīng)的試驗(yàn)，結(jié)果表明：較低質(zhì)量濃度的醋酸鉛（0.1 mg/L）和氯化汞（0.01 mg/L）能極顯著地誘發(fā)蠶豆根尖微核的形成，且醋酸鉛和氯化汞的劑量與蠶豆根尖細(xì)胞微核率之間存在一定的劑量——反應(yīng)關(guān)系。

在本試驗(yàn)中，誘發(fā)最大微核率離子溶液的質(zhì)量濃度，Hg2+＜Pb2（+Hg2+誘發(fā)最大微核率（22.75±0.86）時(shí)的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L，而Pb2+誘發(fā)最大微核率（27.73±0.93）時(shí)的質(zhì)量濃度為50.0 mg/L）；在兩溶液的質(zhì)量濃度相同（均為0.1 mg/L或1.0 mg/L）時(shí)，氯化汞對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘發(fā)率大于醋酸鉛（濃度為0.1 mg/L時(shí)，氯化汞誘發(fā)的微核率為19.50± 0.71，醋酸鉛為14.90±1.03；濃度為1.0 mg/L時(shí)，氯化汞誘發(fā)的微核率為22.75±0.86，醋酸鉛為18.57± 0.51）。由此可見，氯化汞的遺傳毒性大于醋酸鉛。

蠶豆根尖微核技術(shù)應(yīng)用的一個(gè)主要領(lǐng)域就是檢測(cè)水體的致突變性，在自然水體方面，引入PI概念后，把微核率與污染程度聯(lián)系起來(lái)，根據(jù)測(cè)試水樣微核率與自來(lái)水對(duì)照，確定污染指數(shù)，再根據(jù)污染指數(shù)的大小進(jìn)行水體污染分區(qū)。根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》，0.00＜PI≤1.50時(shí)，為基本無(wú)污染，1.50＜PI≤2.00時(shí)，為輕度污染，2.00＜PI≤3.50時(shí)，為中度污染，PI＞3.50時(shí)，為重度污染。

蠶豆是微核技術(shù)檢測(cè)常用的材料，通過(guò)醋酸鉛和氯化汞對(duì)蠶豆根尖誘導(dǎo)的微核效應(yīng)試驗(yàn)，可了解到排入生態(tài)系統(tǒng)中的微量鉛和汞（尤其是汞，極小劑量的汞就能引起較高微核效應(yīng)的產(chǎn)生）對(duì)植物及人體存在的潛在遺傳危害，并由此推論排入生態(tài)系統(tǒng)中的微量鉛和汞可能有致突變作用，會(huì)對(duì)人體或其他生物體造成危害。

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MCN Effects of the Heavy Metal ions Pb2+and Hg2+on the Vicia faba Root Cell

KONG Lingfang,ZHU Hongqiong,YANG Xiaoxia*
（College of Agriculture and Biology Science,Dali University,Dali,Yunnan 671003,China）

Micronucleus effects of the heavy metal ions Pb2+and Hg2+on Vicia faba root cells were investigated with different concen?trations of lead acetate and mercuric chloride.The results showed that within certain range of concentrations,both Pb2+and Hg2+can in?duce high micronucleus frequency（MCNF）of Vicia faba root cells with a dose dependent manner,however,MCNF was found not to in?crease in a linear pattern with high Pb2+and Hg2+concentration.So Vicia faba could be used as the material for fast detection of the genotoxicity of Pb2+and Hg2+in enviroment.

Pb2+;Hg2+;Vicia faba root cells;MCNF

Q336［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］1672-2345（2011）04-0051-03

2011-01-17

孔令芳,助教，主要從事園林植物與觀賞園藝研究.

*通信作者：楊曉霞，教授，E-mail:dlxy-yxx@163.com.

（責(zé)任編輯 李 明）