化學發光酶免疫法檢測玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

楚金申，許 楊，何慶華，盧 江

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室中德聯合研究院，江西南昌330047)

化學發光酶免疫法檢測玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

楚金申，許 楊*，何慶華，盧 江

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室中德聯合研究院，江西南昌330047)

應用抗脫氧鐮刀菌烯醇單克隆抗體，以辣根過氧化物酶催化魯米諾-過氧化氫化學發光體系，建立了一種簡便、快速、高特異性的間接競爭化學發光酶免疫法用于檢測谷物中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。所建立的方法分析靈敏度為10.7ng/mL，批內變異系數小于8.1%，批間變異系數小于12.8%，玉米的加標回收率為91.2%～99.5%，與其他常見真菌毒素未見明顯交叉，所建立的標準曲線相關系數為0.9902，檢測線性范圍為12.9～163.7ng/mL，檢測時間為40min。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，間接競爭化學發光酶免疫法(CLEIA)，檢測

圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的結構式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體腹水、DON人工抗原(DON-HG-BSA) 實驗室自制;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、伏馬菌素 B1(Fumonisins B1，FB1)、伏馬菌素B2(Fumonisins B2， FB2)、赭曲霉毒素 A(ochratoxin A，OTA)、黃曲霉毒素B1(Aflatoxins B1)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、羊抗鼠IgG-HRP Sigma;辣根過氧化物酶(HRP)(RZ＞3) 上海生工;化學發光底物液Pierce公司(USA);檢測DON的ELISA試劑盒 南昌博恒。

化學發光檢測儀 Thermo公司(USA);96孔化學發光板條 購自深圳金燦華有限公司;酶標儀Thermo公司(USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 間接競爭酶聯免疫分析法(ELISA) 用0.05mol/mL磷酸緩沖液稀釋抗原至1.5μg/mL，向微孔板中每孔加100μL，4℃包被12h，PBST洗滌液洗3次，每孔加300μL封閉液(5%的脫脂牛奶)，37℃封閉1h后，甩去封閉液洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔中分別加入系列稀釋的DON標準品(0、10、20、50、100、200、400ng/mL)或樣品 50μL，同時加入1∶60000倍稀釋的抗體溶液50μL，混勻，37℃溫育30min，洗滌4次，加入1∶2000稀釋的羊抗鼠IgGHRP，100μL/孔，37℃溫育30min，洗滌4次，拍干，加100 μL TMB顯色液，顯色反應5min后加2mol/L硫酸50μL終止反應，并于 450nm處檢測吸光度(OD450nm)。

1.2.2 間接競爭化學發光免疫法(CLEIA) 用0.05mol/mL磷酸緩沖液稀釋抗原至1.0μg/mL，向微孔板中每孔加100μL，4℃包被12h，然后用PBST洗滌液洗3次，每孔加300μL封閉液(5%的脫脂牛奶)，37℃封閉1h后，甩棄封閉液洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔中加入系列稀釋的DON標準品(0、5、10、20、50、100、200ng/mL)或樣品50μL，同時加入1∶10000倍稀釋的抗體溶液50μL，混勻，37℃溫育10min，洗滌4次，加入1∶1000稀釋的羊抗鼠IgGHRP，100μL/孔，37℃溫育30min，洗滌4次，拍干，每孔加發光底物液100μL，用化學發光檢測儀測量相對發光強度單位(relative light units，RLU)。

1.2.3 檢測條件的確定 采用方陣滴定［10］確定ELISA抗原和抗體反應的工作濃度。據文獻表明［11］，RLUmax/IC50越大，CLEIA的靈敏度和重復性越好，因此引入RLUmax/IC50評價各種因素的影響。按照1.2.2操作步驟分別對包被濃度、抗體工作濃度和競爭反應時間、羊抗鼠IgG-HRP的工作濃度和孵育時間優化。

1.2.4 方法學分析 a.標準曲線:準確稱取4.0mg DON標準品溶于1mL蒸餾水中，配制成4mg/mL DON標準品母液，將DON標準品母液分別稀釋至終濃度為5、10、20、50、100、200、400ng/mL，參照文獻［11］建立CLEIA標準曲線。

b.靈敏度:對零標準點平行測定10次，計算相對發光強度的平均值及其標準偏差，再由平均值減去兩倍標準偏差得出的值代入校準曲線所求得的濃度即是靈敏度，重復實驗3次，計算平均靈敏度。

1.動手實踐。學生是課堂的主體。“眼過千變不如手過一遍”，書本中的知識是研究者留下的精華，然而要真正理解這些知識，還需為學生創造更多的動手機會，親自探索知識背后的奧秘。例如，在探究求“平行四邊形面積方法”時，老師為學生準備了不同材料，引導學生將這些平行四邊形進行分拆和轉變，平行四邊形可拆成兩個三角形，也可成為三角形和長方形結合，或也可以轉化成兩個梯形……不同的學生會從不同的角度思考問題，結果也就多樣化，這種多樣化的知識引導，讓學生思考的角度也變的新穎。

c.批內批間變異:隨機抽取板條分別進行3個批次的包被，每批次6個平行進行測定，分別計算IC50的批內及批間變異。

d.回收率:在玉米樣品中分別添加 50、100、150μg/kg的DON標準品，依照1.2.5進行樣品提取，分別用ELISA試劑盒和CLEIA檢測樣品濃度。

e.特異性:選取五種常見的真菌毒素:黃曲霉毒素B1(AFB1)、伏馬菌素B1、伏馬菌素B2、玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)，采用CLEIA方法測定了與DON的交叉反應。

1.2.5 樣品提取 稱取5g粉碎樣品置于100mL具塞三角瓶內，準確加入25mL超純水。將加入水的樣品放入振蕩器內，充分振蕩3min后，用定性濾紙過濾，取濾液4mL，加入4mL超純水，混勻，用定性濾紙過濾，濾液為樣品待檢液。

2 結果與分析

2.1 化學發光免疫分析法的建立

2.1.1 抗原包被濃度的選擇 采用檸檬酸緩沖液分別稀釋抗原至0.25、0.5、1.0、2.0μg/mL，其他步驟參照1.2.2。結果如圖2所示，由圖2可見，IC50隨著抗原包被濃度的增大先減小然后增大，RLUmax/IC50隨著抗原濃度的增大先增大然后減小，在抗原濃度為1.0μg/mL時達到最大，因此選用1.0μg/mL作為抗原包被濃度。

圖2 CLEIA抗原包被濃度的優化

圖3 CLEIA抗體稀釋倍數的優化

2.1.3 競爭反應時間的選擇 按照1.2.2操作步驟分別選擇競爭反應時間為5、10、15、20、25min進行實驗，結果如圖4所示。由圖4可見，隨著競爭時間的延長，IC50呈現逐漸增大的趨勢，RLUmax/IC50在10min時達到最大，選定10min作為競爭反應時間。

2.1.4 羊抗鼠IgG-HRP孵育時間的確定 按照1.2.2操作步驟分別選擇羊抗鼠IgG-HRP孵育時間為25、30、35、40、45min進行實驗。實驗結果如圖5所示。由圖5可見，隨著孵育時間的增長，IC50先減小然后增大，RLUmax/IC50先增大然后減小，在30min時達到最大，選定30min作為孵育時間。

圖4 CLEIA競爭反應時間的優化

圖5 CLEIA羊抗鼠IgG-HRP孵育時間的優化

2.1.5 羊抗鼠IgG-HRP工作濃度的確定 用磷酸緩沖液將抗體分別稀釋1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶6000稀釋羊抗鼠IgG-HRP，其他步驟參照1.2.2。實驗結果如圖6、表1所示。由圖6可見，隨著羊抗鼠IgG-HRP稀釋倍數的增大，RLUmax/IC50逐漸減小，但從表1中可以看出若羊抗鼠IgG-HRP稀釋倍數過小，發光本底會急劇增大，因此選定1∶1000作為羊抗鼠IgG-HRP工作濃度。

表1 羊抗鼠IgG-HRP稀釋倍數對發光本底的影響

圖6 CLEIA羊抗鼠IgG-HRP工作濃度的優化

2.1.6 發光底物液量的確定 按照1.2.2操作步驟，最后每孔分別加入化學發光底物液70、100、130、160μL用化學發光儀進行測定。結果如圖7所示。由圖7可見，當每孔加入130μL進行測定時，IC50最小，RLUmax/IC50最大，選定化學發光底物液加入量為130μL。

2.2 方法學評價

2.2.1 標準曲線 按照1.2.4繪制CLEIA標準曲線見圖8。線性回歸方程為Y=-23.6Ln(X)+140.5 (R2=0.9902)，IC50=46.01g/mL，檢測范圍(IC20～IC80)為12.9～163.7ng/mL。

圖7 化學發光底物加入量的優化

圖8 CLEIA的標準曲線

2.2.2 靈敏度和精密度 按照1.2.4計算得CLEIA平均靈敏度為10.7ng/mL，較ELISA試劑盒的靈敏度30.8ng/mL(IC85)提高了2.88倍。

按照1.2.4分別計算IC50的批內及批間變異，結果見表2。

表2 CLEIA對DON測定的精密度

2.2.3 回收率 按照1.2.4回收率檢測結果見表3，由表3可知，CLEIA的加標回收率在91.2%以上。

表3 CLEIA對DON測定的加標回收率

2.2.4 特異性 選取五種常見的真菌毒素:黃曲霉毒素B1(AFB1)、伏馬菌素B1、伏馬菌素B2、玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)，采用CLEIA方法測定了與DON的交叉反應率，結果見圖9，未見有交叉反應。

圖9 CLEIA常見真菌毒素的交叉反應

2.3 CLEIA樣品測定與ELISA試劑盒的比較

分別采用CLEIA和 ELISA試劑盒測定了在南昌市場上隨機購買的40份玉米樣品，兩種方法的所測結果見表4，以CLEIA的測定值為X軸，ELISA試劑盒測定值為Y軸，作圖得相關曲線，如圖10所示，線性擬合的方程為 Y=1.012X-53.46，相關系數為0.934。

表4 CLEIA和ELISA試劑盒的樣品測定結果(μg/kg)

圖10 CLEIA的測定值與ELISA測定值的相關性

3 結論

3.1 采用HRP催化魯米諾-過氧化氫化學發光體系，優化并確定了化學發光酶免疫反應的條件為:稀釋抗原至1.0μg/mL，4℃孵育包被12h，1∶10000稀釋DON抗體競爭反應 10min，1∶1000稀釋羊抗鼠IgG-HRP孵育反應30min后每孔加入130μL化學發光底物液。

3.2 建立了一種測定玉米中DON化學發光酶免疫分析方法，方法分析靈敏度為10.7ng/mL，批內變異系數小于8.1%，批間變異系數小于12.8%，以玉米為樣品的分析回收率為91.2%～99.5%，與其他常見真菌毒素未見明顯交叉，所建立的標準曲線相關系數為0.9902，檢測線性范圍為12.9～163.7ng/mL，樣品檢測時間為40min。

3.3 建立的CLEIA與ELISA相比靈敏度提高了2.88倍。采用CLEIA和ELISA試劑盒測定了40份市場樣品，并進行了對照，兩者的線性相關系數為0.934。

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Chemiluminescence enzyme immunoassay for the determination of deoxynivalenol in corn

CHU Jin-shen，XU Yang*，HE Qing-hua，LU Jiang
(Sino-Germany Joint Research Institute，The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

A sensitive indirect competitive chemiluminescence’s enzyme immunoassay(CLEIA)for deoxynivalenol in corn was developed.The optimized CLEIA gave a limit detection of 10.7ng/mL and a detection range of 12.9～163.7ng/mL，with an IC50of 46.01ng/mL and it was about 4.01 times more sensitive than that of colorimetric ELISA. It had been validated on cereals samples in terms of precision(intra-and interassay coefficient variations of less than 8.1%and 12.8%，respectively)and accuracy(mean recovery 91.2%～99.5%).These assay performances indicated that CLEIA was capable of being applied for the specific detection and routine monitoring of DON in corn samples.

deoxynivanol;CLEIA;detection

TS207.3

A

1002-0306(2011)09-0407-04

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivanol，DON)，是一種單端孢霉烯族真菌毒素，分子結構式如圖1所示，主要由禾谷鐮刀菌產生，污染玉米、小麥和大麥等谷物及其制品［1］，具有免疫毒性、胚胎毒性和細胞毒性等［2-3］，所有的動物都會對DON有不同程度的過敏反應，其中豬的反應最為強烈［4］。我國規定谷物及其制品中DON的限量標準為1mg/kg(1000ng/kg)［5］。目前常用的檢測DON的方法主要有高效液相色譜(HPLC)法［6］、氣相色譜法(GC/MS)［7］和酶聯免疫吸附法(ELISA)［8］等。前兩種方法靈敏、準確，但耗時，費力，成本高且需要昂貴的設備和專業的人員操作;酶聯免疫吸附法快速、特異性好，但靈敏度不夠高。間接競爭化學發光酶免疫法既具有放射免疫法的高靈敏度，又具有酶聯免疫法操作簡便、快速的特點，線性范圍寬、測試中無需使用對人體有害的試劑［9］。本研究采用魯米諾-過氧化氫化學發光體系建立了檢測玉米種DON的間接競爭化學發光酶免疫法(CLEIA)。該方法靈敏度高、特異性好、簡單快速。

2010-09-14 *通訊聯系人

楚金申(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:工業微生物。

“國家高技術研究發展計劃”項目資助(2007AA10Z427)。