三斑海馬酶解工藝的優(yōu)化及其液化蛋白對(duì)DPPH·的清除作用

袁學(xué)會(huì)，陳成波，陳 政，易美華，*

(1.海南大學(xué)，海南海口570228;2.海南壹號(hào)藥業(yè)有限公司，海南海口570311)

三斑海馬酶解工藝的優(yōu)化及其液化蛋白對(duì)DPPH·的清除作用

袁學(xué)會(huì)1，陳成波2，陳 政2，易美華1，*

(1.海南大學(xué)，海南海口570228;2.海南壹號(hào)藥業(yè)有限公司，海南海口570311)

為了優(yōu)化三斑海馬酶解工藝并對(duì)其液化蛋白進(jìn)行抗氧化研究，本文采用酶法工藝對(duì)三斑海馬進(jìn)行液化蛋白的提取，以酶解率為指標(biāo)，采用了4組單因素實(shí)驗(yàn)、16組正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，以DPPH自由基的清除率來(lái)衡量三斑海馬液化蛋白的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三斑海馬在使用堿性蛋白酶，料液比1∶10、反應(yīng)時(shí)間6h、酶用量1%時(shí)提取的液化蛋白水解率最高;三斑海馬液化蛋白具有較高的抗氧化活性，對(duì)DPPH·的IC50為0.07mg/mL，高于維生素C。

三斑海馬，酶解率，DPPH法，抗氧化活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海馬 購(gòu)自海口廣安堂大藥房，經(jīng)認(rèn)定為三斑海馬;堿性酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 無(wú)錫市杰能科生物科技有限公司;DPPH Sigm公司，分析純;維生素C、無(wú)水乙醇、四氯化碳、氫氧化鉀、酒石酸鉀鈉、硫酸銅(CuSO4·5H2O)等其它試劑 均為分析純。

722分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;分析天平 上海良平儀器儀表有限公司;雷磁pH計(jì)上海精科儀器有限公司;HH-S26S電熱恒溫水浴鍋 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠;JB90-D型強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;移液槍 美國(guó)熱電公司(Thermo)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)項(xiàng)目和方法

1.2.1.1 液化蛋白的測(cè)定 以牛白蛋白為樣，先以凱氏定氮法核準(zhǔn)牛白蛋白中蛋白質(zhì)含量，再通過(guò)雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(使蛋白質(zhì)含量在40～110mg之間)，得到回歸方程y=0.0046x+0.0845，R2=0.9977，表明在此范圍內(nèi)呈良好的線性。

1.2.1.2 酶解率的測(cè)定

酶解率DH(%)=酶解液中可溶性蛋白/55.6% A×100%

式中:55.6%為海馬蛋白質(zhì)對(duì)海馬干基相關(guān)系數(shù);A為海馬干基質(zhì)量。

1.2.1.3 抗氧化活性的測(cè)定［8-10］

作用模式:AH+DPPH·—→DPPH-H+A·

稱取DPPH試劑12.80mg，用50%乙醇溶解，定量轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻得濃度為256.1mg/L DPPH儲(chǔ)備液(約6.5×10-4mol/L)，用錫紙包好，置于冰箱中冷藏備用。使用前用50%乙醇稀釋至濃度為25.61mg/L(約6.5×10-5mol/L)。

將6.5×10-5mol/L的DPPH·溶液室溫下靜置10min后放入分光光度計(jì)中對(duì)DPPH溶液進(jìn)行600～400nm可見(jiàn)光區(qū)掃描，得其吸收光譜在可見(jiàn)光區(qū)λ= 517nm處有最大吸收峰位。所以本研究以波長(zhǎng)517nm的吸光度來(lái)表示DPPH含量的變化。

測(cè)定樣品自由基清除能力時(shí)，將樣品液同樣配制為50%乙醇，并且準(zhǔn)備不同多肽濃度的樣品液，分別按照表1加入反應(yīng)液。

表1 試樣加樣表

將Ai所表示的樣品室溫下反應(yīng)30min后，在分光光度計(jì)517nm處測(cè)定各吸收值(A0、Ai、Aj)，每個(gè)濃度重復(fù)3次，求得清除率平均值。

樣品對(duì) DPPH自由基清除能力(scavenging activity，SA)計(jì)算公式如下:

SA(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%

抗氧化劑清除DPPH自由基能力采用半清除率值(IC50)表示。測(cè)定樣品液濃度與DPPH自由基清除率，并繪制DPPH自由基清除率對(duì)樣品液濃度的曲線，通過(guò)方程計(jì)算清除率為50%時(shí)所需樣品液的濃度，即為IC50值。

1.2.2 工藝流程 三斑海馬→烘干→剪碎→酶解→測(cè)定液化蛋白含量→配制DPPH試劑→測(cè)定抗氧化活性

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 通過(guò)4組單因素實(shí)驗(yàn)得到了不同條件對(duì)三斑海馬酶解率的影響規(guī)律，如表2所示，根據(jù)結(jié)果設(shè)計(jì)L16(43)正交實(shí)驗(yàn)，以期獲得最佳工藝條件以及各個(gè)因素的主次順序。

表2 實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

在三斑海馬液化蛋白提取工藝研究中，以酶解率的高低為考察因素，先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察不同條件對(duì)三斑海馬酶解率的影響規(guī)律，再通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出提取的最佳工藝組合以及各個(gè)因素的主次順序。

2.1 海馬酶解的工藝優(yōu)化

2.1.1 酶類型的選擇 選擇胰蛋白酶、堿性酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶四種酶在料液比1∶15，時(shí)間6h，加酶量1%，并分別在最佳pH和溫度下進(jìn)行反應(yīng)(見(jiàn)表3)，結(jié)果如圖1所示。

表3 不同酶的最佳pH和溫度

圖1 酶類型對(duì)酶解率的影響

由圖1可知，在上述條件下，海馬酶解率的高低順序是:堿性酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胃蛋白酶，堿性酶與胃蛋白酶的酶解率相差甚遠(yuǎn)，堿性酶的酶解率高達(dá)54.4%，因此，選擇堿性酶對(duì)海馬進(jìn)行酶解。

2.1.2 料液比的選擇 選擇堿性酶，在溫度60℃，pH9.5，加酶量1%，酶解時(shí)間6h的條件下，將料液比分為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20四個(gè)梯度，每隔1h測(cè)一次酶解率，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，酶解率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)料液比為1∶5時(shí)，酶解速率慢，終點(diǎn)值低，當(dāng)料液比為1∶10、1∶15、1∶20時(shí)，海馬酶解率曲線基本一致，速率比較快，終點(diǎn)值也幾乎重合。

實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)料液比大時(shí)，底物濃度過(guò)高，分散不均勻，過(guò)多底物分子堆集于酶的活動(dòng)中心，從而會(huì)影響催化速度及產(chǎn)物分子的擴(kuò)散，故酶解率較低;料液比過(guò)大的話，一方面雖然使底物分散更均勻，溶解度增加，溶液中相對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量低，為以后的濃縮等帶來(lái)麻煩，故選擇料液比要綜合考慮。

圖2 料液比對(duì)海馬酶解率的影響

2.1.3 酶解時(shí)間的選擇 選擇堿性酶，在溫度60℃，pH9.5，料液比1∶10，加酶量1%時(shí)，酶解9h，每1h測(cè)酶解率與pH，觀察酶解率與時(shí)間和pH之間的變化關(guān)系，結(jié)果如圖3顯示。

圖3 pH和酶解率與海馬酶解時(shí)間關(guān)系對(duì)照?qǐng)D

由圖3可知，海馬在堿性酶酶解過(guò)程中，pH隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，酶解率隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，并都在時(shí)間為5h時(shí)減緩或者終止變化。蛋白質(zhì)與pH呈反比關(guān)系，可能是因?yàn)楹ｑR酶解出的可溶蛋白暴露出來(lái)的羧基比氨基要多，所以溶液pH緩慢降低，直至反應(yīng)終止。

2.1.4 酶用量的選擇 選擇堿性酶，在溫度60℃，pH9.5，料液比1∶10，酶解時(shí)間為5h的條件下，將加酶量分為0.5%、1%、1.5%、2%四個(gè)梯度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、酶解率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶用量對(duì)海馬酶解率的影響

由圖4可知，當(dāng)加酶量最低為0.5%時(shí)，酶解率曲線起點(diǎn)和終點(diǎn)都比較低，曲線平緩上升，當(dāng)加酶量為1%、1.5%、2%時(shí)，起點(diǎn)值略有不同，曲線軌跡平緩上升，但是終點(diǎn)值幾乎一樣，說(shuō)明此時(shí)酶用量的不同對(duì)酶解率的最終結(jié)果影響不大。

2.1.5 海馬液化蛋白酶解正交實(shí)驗(yàn) 通過(guò)設(shè)計(jì)L16(43)正交實(shí)驗(yàn)(表2)以確定提取海馬液化蛋白最佳酶解工藝。由表4可知，提取海馬液化蛋白最佳酶解工藝為A2B3C2，即料液比1∶10、反應(yīng)時(shí)間6h、酶用量1%，在此條件下酶解率最高，達(dá)到67%。

表4 海馬液化蛋白酶解正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)中，RB＞RA＞RC，所以各個(gè)因素的主次順序?yàn)?B(反應(yīng)時(shí)間)＞A(料液比)＞C(酶用量)。

2.2 海馬液化蛋白的抗氧化研究

2.2.1 海馬液化蛋白對(duì)DPPH自由基的清除作用

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳工藝對(duì)海馬進(jìn)行酶解，得到海馬液化蛋白酶解液，測(cè)得酶解率為67%。根據(jù)1.2.1.3所述，將酶解液稀釋，配制成多個(gè)不同多肽濃度的樣液，分別測(cè)定，得到海馬液化蛋白對(duì)DPPH自由基清除作用的影響曲線，如圖5所示。

圖5 海馬液化蛋白對(duì)DPPH自由基清除作用的影響

由圖5可知，隨著海馬液化蛋白濃度的升高，其對(duì)自由基清除率也逐漸升高，并且曲線有一個(gè)明顯拐點(diǎn)，拐點(diǎn)前7個(gè)點(diǎn)的海馬多肽濃度從0.0014mg/mL升到0.35mg/mL，自由基清除率從4.2%升至75.59%，X軸點(diǎn)與點(diǎn)之間密集，Y軸變化劇烈，但拐點(diǎn)后5個(gè)點(diǎn)X軸點(diǎn)與點(diǎn)間距較大，Y軸變化較小，說(shuō)明當(dāng)海馬多肽濃度比較小時(shí)對(duì)自由基清除率的影響較大，但達(dá)到一定濃度時(shí)海馬多肽對(duì)自由基清除率的影響變小。

當(dāng)對(duì)DPPH自由基清除率為50%時(shí)海馬液化蛋白的濃度為0.07mg/mL，即IC50=0.07mg/mL。

為了對(duì)海馬液化蛋白的抗氧化性進(jìn)行直觀的評(píng)價(jià)，我們選擇常用抗氧化劑維生素C做比較，測(cè)得維生素C的IC50=0.331mg/mL，即維生素C在同等條件下對(duì)DPPH自由基的清除率為50%時(shí)，海馬液化蛋白的抗氧化能力是維生素C的4.73倍，具有較強(qiáng)的抗氧化性。

3 結(jié)論

3.1 三斑海馬液化蛋白提取的最佳條件是，選擇堿性酶、pH為9.5、溫度60℃、料液比1∶10、反應(yīng)時(shí)間6h、酶用量1%，此時(shí)三斑海馬酶解率高達(dá)67%，為最佳工藝。各個(gè)因素的主次順序?yàn)?B(反應(yīng)時(shí)間)＞A (料液比)＞C(酶用量)。

3.2 通過(guò)DPPH法以維生素C為對(duì)照對(duì)三斑海馬液化蛋白的抗氧化活性進(jìn)行的考察表明，三斑海馬液化蛋白具有較強(qiáng)的抗氧化能力，同等條件下比抗氧化劑維生素C要強(qiáng)4.73倍。

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Study on optimization of enzymatic and the antioxidant activity to DPPH·of liquid protein of Three-spot hippocampus

YUAN Xue-hui1，CHEN Cheng-bo2，CHEN Zheng2，YI Mei-hua1，*
(1.Hainan University，Haikou 570228，China; 2.Hainan No.1 Pharmaceutical Company Limited，Haikou 570311，China)

In order to study on optimization of enzymatic and the antioxidant activity of liquid protein of Three-spot hippocampus，extraction of soluble protein by enzyme，used 4 single-factor experiment and 16 groups of orthogonal to optimization，measured three-spot hippocampus antioxidant activity of liquid protein by the clear rate to DPPH.The results indicated:when we use alkaline protease，Liquid ratio 1∶10，reaction time 6h，1%enzyme dosage the soluble protein hydrolysis was highest;Three-spot hippocampus antioxidant activity of liquid protein was high，the IC50was 0.07mg/mL，higher than the vitamin C.

Three-spot hippocampus;hydrolysis rate;DPPH method;antioxidant activity

TS254.1

B

1002-0306(2011)09-0291-04

海馬異名為水馬(《抱樸子》)，鯫姑(《海南介語(yǔ)》)，龍落子、馬頭魚(《動(dòng)物學(xué)大辭典》)。為海龍科，品種有線紋海馬 Hippocampus Kelloggi Jordan et Snyder、刺海馬 Hippoxamoud kuda Bleeker、三斑海馬Hippocampus trimaculatus Leach 、 小 海 馬Hippocampusjaponicus Kaup等，是珍貴的海產(chǎn)魚類，被譽(yù)為“南海人參”。海馬中含有大量的生理活性物質(zhì)，有著很高的藥用價(jià)值［1-2］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，海馬水、醇提取物具有促進(jìn)小鼠抗應(yīng)激，增強(qiáng)小鼠的記憶能力，增加小鼠血中的SOD含量，降低小鼠肝中的過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO)的含量(即降血脂作用)，抑制小鼠腦內(nèi)MAO-B活性及促進(jìn)血液流變學(xué)改變和改善微循環(huán)的作用［3］;斑海馬具有明顯的抗血栓藥理作用，能明顯抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性頸動(dòng)脈血栓和大鼠腦血栓的形成，為海馬疏氣活血功效提供理論依據(jù)［4］。大海馬、海馬、剌海馬、斑海馬、三斑海馬的提取物，對(duì)L-谷氨酸致大鼠神經(jīng)元鈣內(nèi)流有明顯的抑制作用，鈣離子進(jìn)入神經(jīng)元在興奮性氨基酸L-谷氨酸致神經(jīng)無(wú)潰變和壞死過(guò)程中起重要作用［5］。DPPH (1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl即 1，1-二苯-2-苦肼基)由于苯環(huán)的共軛和位阻及硝基的電子作用，是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，DPPH的單電子被配對(duì)而使其紫色變淺，吸收光度變小，而吸收光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線性關(guān)系［6-7］，因此用其來(lái)檢測(cè)自由基清除情況，以判斷三斑海馬液化蛋白的抗氧化能力，為合理開發(fā)海馬提供理論依據(jù)。

2010-11-30 *通訊聯(lián)系人

袁學(xué)會(huì)(1986-)，男，在讀研究生，研究方向:資源開發(fā)與利用。

海口市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009-019)。