乙醇溶液體系中Span修飾豬胰脂酶的研究

曾 俊，楊國龍，畢艷蘭，張 潔，孫尚德

(河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450052)

乙醇溶液體系中Span修飾豬胰脂酶的研究

曾 俊，楊國龍*，畢艷蘭，張 潔，孫尚德

(河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450052)

在乙醇-水溶液體系中采用Span系列表面活性劑對豬胰脂酶進行了修飾，以其催化酯交換的交換量為指標衡量修飾的效果，并且比較了修飾酶與未修飾酶的熱穩定性差異。結果表明:40℃下30min即可完成Span對豬胰脂酶的修飾，但各種表面活性劑修飾的最佳條件并不相同。Span20修飾脂肪酶的最佳條件是水與乙醇的比例為4∶1(v/v)，Span20用量為25%;Span40修飾豬胰脂酶的最佳條件是水與無水乙醇的比例為2∶1(v/v)，Span40用量為20%; Span65修飾豬胰脂酶的最佳條件為水與無水乙醇的比例為1∶1(v/v)，Span65的用量為20%;Span60、Span80和Span85修飾脂肪酶的最佳條件是水與無水乙醇的比例為3∶1(v/v)，用量均為20%。通過修飾后酶的熱穩定性實驗可以看出，六種表面活性劑修飾的酶在30～70℃間催化反活性都高于未修飾酶，在40℃下，修飾酶的催化活性基本達到最高，而未修飾酶要70℃才能達到最高催化活性。Span60修飾脂肪酶的效果優于其它五種表面活性劑。

豬胰脂酶，Span，修飾，乙醇溶液

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬胰脂酶 購于Novo公司;茶油 購于河南信陽長園野生茶油有限公司;棕櫚酸、Span表面活性劑購于Sigma公司;其他化學試劑 均購于天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純。

氣相色譜儀 Agilent6890N，美國Agilent公司;色譜柱 BPX-70(30.0m×250μm×0.25μm)，澳大利亞SGE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬胰脂酶的修飾

1.2.2 修飾前后脂肪酶促酯交換反應催化活性的測定 稱取3g茶油于50mL燒瓶中，加入一定量棕櫚酸，反應底物比為棕櫚酸∶茶油=2∶1(mol/mol)，加入脂肪酶為茶油重的15%(m/m)，加入異辛烷30mL，體系含水量為體系總重的0.5%，在40℃下攪拌反應4h。分離混合物中的甘三酯，進氣相分析脂肪酸組成。以4h后的酯交換量來評價脂肪酶修飾前后的催化活性。催化活性(酯交換反應的交換量) =產物甘三酯中棕櫚酸的百分含量-原料茶油中棕櫚酸的百分含量。

1.2.3 甘三酯脂肪酸組成分析 將0.5mL反應產物溶解于1.0mL石油醚中，然后進行薄層層析(吸附劑為硅膠G，展開劑為石油醚-無水乙醚-甲酸混合物，石油醚∶無水乙醚∶甲酸=70∶30∶1，v/v/v)，再將薄層板置于通風櫥中晾干，并將2，7-二氯熒光素均勻地噴在薄層板上，晾干后放于紫外分析儀上觀察并刮下甘三酯譜帶［7］。

將從薄層板上刮下的甘三酯譜帶(甘三酯與硅膠的混合物)溶于 2.5mL正己烷中，加入 1mL 0.5mol/L甲醇鈉溶液，室溫下輕搖5min，然后加入少量無水硫酸鈉，靜置1h后，于2000～3000r/min離心2～3min，取上清液用于GC分析［7］。

原料茶油及酶催化反應產物甘三酯脂肪酸組成分析條件:氣相色譜儀:Agilent6890N;色譜柱:BPX-70 (30.0m×250μm×0.25μm);進樣口溫度:230℃;柱溫: 180℃;檢測器溫度:300℃;氮氣流速:1.5mL/min。

2 結果與討論

2.1 水與無水乙醇的比例對修飾效果的影響

無水乙醇與水的比例對修飾效果的影響見圖1。就Span20修飾豬胰脂酶的效果而言，催化活性隨無水乙醇用量的減小先增加后減小，水與無水乙醇的比例為4∶1(v/v)時豬胰脂酶的催化活性達到極大值;用Span40修飾豬胰脂酶時，催化活性隨無水乙醇用量的減小先增加后減小，水與無水乙醇的比例為2∶1(v/v)時豬胰脂酶的催化活性達到極大值;用Span60修飾豬胰脂酶時，其活性隨乙醇用量的減小而逐漸增加，水與無水乙醇的比例大于3∶1(v/v)以后，豬胰脂酶的催化活性較高并趨于穩定;用Span65修飾豬胰脂酶時，催化活性隨無水乙醇用量的減小先增加后減小，水與無水乙醇的比例為1∶1(v/v)時豬胰脂酶的催化活性達到極大值;用 Span80和Span85修飾豬胰脂酶時，催化活性隨無水乙醇用量的減小先增加后減小，水與無水乙醇的比例為3∶1 (v/v)時豬胰脂酶的催化活性達到極大值。Kamiya等［8］研究表面活性劑修飾過程中采用緩沖溶液/乙醇(v/v)混合體系，在乙醇體積占總體積的0%～20%時，對修飾酶活性略有提高，混合體系可以提高表面活性的分散性，而且還可以改變酶的溶解性。

圖1 水與無水乙醇的比例對豬胰脂酶修飾效果的影響注:攪拌時間:30min;Span用量:25%(Span占豬胰脂酶與Span總量的質量百分數);溫度:40℃。

2.2 Span用量對修飾效果的影響

Span占Span和酶總重的百分比對修飾酶催化反應活性的影響見圖2。由圖可以看出，對于Span40、65、80和85來說，在用量為20%時修飾效果達到最佳，增加Span的用量對酶的修飾并沒有很大的影響;Span60在用量為20%修飾效果最佳，隨后增大用量，修飾效果略有下降;Span20最佳的修飾用量為25%。較低和較高的Span用量都會降低對豬胰脂酶的修飾效果。Thakar等［9］研究發現，修飾過程中表面活性劑的種類和用量對修飾酶催化酯交換反應有重要的影響，非離子型表面活性劑修飾效果比陽離子型的效果好，陰離子型表面活性劑會抑制修飾酶活力，修飾過程中較低的表面活性劑用量能顯著提高修飾酶的活性。

圖2 Span用量對豬胰脂酶修飾效果的影響

2.3 攪拌時間對修飾效果的影響

由圖3可以看出，對于六種表面活性劑修飾的豬胰脂酶，在攪拌時間為30min時，催化酯交換的催化活性最高，隨著攪拌時間的增加，催化酯交換的催化活性略有下降，Span65修飾的豬胰脂酶最為明顯。由此可見，對于六種表面活性劑來說，修飾最佳的攪拌時間為30min，較長或者較短的攪拌時間，都會降低酶催化酯交換反應的催化活性。

圖3 攪拌時間對豬胰脂酶修飾效果的影響

2.4 脂肪酶熱穩定性

對六種表面活性劑修飾酶的熱穩定性進行了研究，主要研究了在30、40、50、60、70、80℃下修飾酶催化酯交換的反應，并用未修飾酶在相同溫度下反應進行比較，實驗結果見圖4。

圖4 修飾酶與未修飾酶的熱穩定性

由圖4可以看出，六種表面活性劑修飾的酶，在30～70℃間，催化活性都高于未修飾酶，是未修飾脂肪酶的1.5～2倍;在40℃時催化活性基本達到最高，40～70℃間的催化活性基本不變，未修飾酶在70℃時催化活性才能達到最高。80℃時修飾酶和未修飾酶的催化活性均急速下降，高溫導致酶失活的緣故; Span60修飾的脂肪酶在相同溫度下的催化活性均高于其它五種。

3 結論

在乙醇-水溶液體系中采用Span系列表面活性劑對豬胰脂酶進行修飾，以催化酯交換反應的交換量為指標，研究修飾條件對豬胰脂酶修飾效果的影響。研究發現:40℃下30min即可完成Span對豬胰脂酶的修飾，但各種表面活性劑修飾的最佳條件并不相同。Span20修飾脂肪酶的最佳條件是水與乙醇的比例為4∶1(v/v)，Span20用量為25%;Span40修飾豬胰脂酶的最佳條件是水與無水乙醇的比例為2∶1 (v/v)，Span40用量為20%;Span65修飾豬胰脂酶的最佳條件為水與無水乙醇的比例為1∶1(v/v)，Span65的用量為20%;Span60、Span80和Span85修飾脂肪酶的最佳條件是水與無水乙醇的比例為3∶1 (v/v)，用量均為20%。通過修飾后酶的熱穩定性實驗可以看出，六種表面活性劑修飾的酶，在30～70℃間催化活性都高于未修飾酶，在40℃下，修飾酶的催化活性基本達到最高，而未修飾酶要在70℃才能達到最高催化活性。Span60修飾脂肪酶的效果優于其它五種表面活性劑。

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Modification of porcine pancreas lipase by Span in ethanol solution

ZENG Jun，YANG Guo-long*，BI Yan-lan，ZHANG Jie，SUN Shang-de
(School of Food Science and Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China)

The porcine pancreas lipase was modified by Span in the ethanol-water solution，the effectiveness of the modification of the porcine pancreas lipase was determined by incorporation of interesterification of oils catalyzed by them，and the thermal stability of the modified lipase and the original lipase were investigated.The results indicated that the modification was finished for 30min at 40℃，however the optimum conditions for Span were different.For Span20，the optimum conditions were the ratio of water to ethanol 4∶1(v/v)，the amount of Span20 25%.For Span40，the optimum conditions were the ratio of water to ethanol 2∶1(v/v)，the amount of Span40 20%. For Span65，the optimum conditions were the ratio of water to ethanol 1∶1(v/v)，the amount of Span65 20%.For Span60，Span80 and Span85，the optimum conditions were the ratio of water to ethanol 3∶1(v/v)，the amount of them 20%.The the catalytic activity of the modified lipase was increased comparison to that of the native lipase in the rang of 30～70℃，the modified lipases showed the better catalytic activity in the range of 40～70℃，while the native lipases showed the better catalytic activity at 70℃.The modification effectiveness of Span60 was better than those of others.

porcine pancreas lipase;Span;modification;ethanol solution

TS201.2+5

A

1002-0306(2011)09-0187-03

脂肪酶除了能催化甘油酯類化合物的水解和合成之外，還可以催化酯交換反應、多肽合成和藥物的合成等，尤其是利用脂肪酶的立體專一性催化合成一些特殊結構的物質，因而脂肪酶在食品、日用化學、油脂化學以及藥物合成等許多領域有廣泛的應用［1］。脂肪酶廣泛存在于原核生物和真核生物中，按其來源可分為三種:動物酶、植物酶和微生物酶［2］。脂肪酶催化的反應是一種界面反應，脂肪酶的結構特性和其在界面上的分布狀態決定催化活性［3］。脂肪酶通過化學修飾后，改變了脂肪酶的表面特性，使底物和脂肪酶更容易發生接觸，從而提高反應速率［4］。Banu Babali等［5］研究在水溶液體系中采用Span 60修飾脂肪酶，修飾后的脂肪酶在異辛烷體系中催化薄荷醇與月桂酸的酯化反應，修飾酶催化反應1h后酯化率81%，4h后達94%，而未修飾酶在72h后才達到93%。Sobhi Basheer等［6］研究采用糖酯修飾的脂肪酶在正己烷體系中催化脂肪醇和長碳鏈脂肪酸的酯化反應，與未修飾酶相比，修飾脂肪酶能提高反應速率。從化學結構上來看，失水山梨醇脂肪酸酯(Span系列)是多元醇的部分脂肪酸酯，它屬于非離子表面活性劑，是一種優良的油包水或水包油型表面活性劑，廣泛地用在食品、化妝品和醫藥等精細化工領域。本文研究在醇溶液體系中采用Span系列表面活性劑修飾豬胰脂酶，S20、S40、S60、S65、S80和 S85分別代表 Span20、Span40、Span60、 Span65、Span80和Span85，探討了最佳的修飾條件和修飾條件對修飾效果的影響。

2010-10-11 *通訊聯系人

曾俊(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:油脂化學。

國家自然科學基金項目(31071558);河南工業大學校科研基金(08XZZ027)。