毛豆腐提取物的自由基清除活性研究

杭 梅，趙新淮

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030)

毛豆腐提取物的自由基清除活性研究

杭 梅，趙新淮*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030)

利用20%、40%、60%乙醇溶液(v/v)、pH4.5水、pH6.5水作為提取溶劑，對(duì)發(fā)酵時(shí)間為3、5、7、9d的毛豆腐分別進(jìn)行提取，測(cè)定提取物中蛋白質(zhì)的提取率、水解度，以及采用DPPH、ABTS法評(píng)價(jià)提取物的體外自由基清除活性。研究結(jié)果表明，隨著毛豆腐發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，提取物中蛋白質(zhì)的提取率、水解度均逐漸增加，并且提取物的自由基清除活性也明顯地提高;通過(guò)比較還發(fā)現(xiàn)，毛豆腐乙醇提取物的自由基清除活性高于水提取物，且隨著乙醇濃度的提高，提取物的自由基清除活性提高。排阻色譜分析結(jié)果證明，發(fā)酵9d后毛豆腐中蛋白質(zhì)充分水解，5種提取物的主要成分為肽與氨基酸。

毛豆腐，提取物，提取率，水解度，自由基清除活性，排阻色譜

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆腐 購(gòu)自市場(chǎng);毛霉 從自然發(fā)酵生產(chǎn)的豆制品中分離獲得;1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、2，2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS) 美國(guó)Sigma公司;其它所用試劑 為分析純?cè)噭?所用水 蒸餾水。

UV-2401PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器中國(guó)有限公司;Kjeltec TM2300型自動(dòng)凱氏定氮儀 瑞士Foss公司;DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;手提式壓力蒸汽滅菌器鎮(zhèn)海金鑫醫(yī)療器械有限公司;H-1型微型漩渦混合器、DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;YH-4BS型遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛豆腐的制作 a.取豆腐，將豆腐對(duì)半切塊，121℃滅菌30min后，稍風(fēng)干除去水滴，然后擺放在竹制的蒸籠內(nèi)，豆腐塊之間應(yīng)保持一定距離，以利于發(fā)酵。b.取毛霉制成菌懸液，用毛刷將菌懸液均勻涂于各表面，再覆蓋好后放入培養(yǎng)箱。c.培養(yǎng)箱溫度控制在15～20℃之間。發(fā)酵過(guò)程中，豆腐表面出現(xiàn)白色絨毛;發(fā)酵后期豆腐軟化并有毛豆腐特有的香氣。

1.2.2 一些化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

1.2.2.1 水分的測(cè)定 105℃烘干法［13］。

1.2.2.2 水溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 凱氏定氮法［14］。分別將不同天數(shù)發(fā)酵好的毛豆腐在 121℃滅酶30min，取出冷卻，除去菌膜后用高速組織搗碎機(jī)搗碎。取一定量樣品進(jìn)行凱氏定氮分析，計(jì)算總蛋白質(zhì)含量，換算系數(shù)為5.71。然后，取75g樣品用蒸餾水定容到250mL，高速組織搗碎機(jī)中12000r/min搗碎1.5min，并在5000r/min離心15min，得到上清液進(jìn)行凱氏定氮分析，計(jì)算水溶性蛋白質(zhì)含量，換算系數(shù)為5.71。實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.2.3 毛豆腐提取物的制備及蛋白質(zhì)提取率測(cè)定取75g毛豆腐分別與20%、40%、60%乙醇溶液(v/v)或pH4.5、pH6.5的水(1mol/L磷酸調(diào)節(jié)pH)混合并定容到250mL作為樣品，之后在高速組織搗碎機(jī)中 12000r/min搗碎 1.5min，5000r/min離心15min，分離上清液得到毛豆腐提取物。乙醇溶液提取物通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后，定容至原體積。各提取物和原始樣品分別進(jìn)行凱氏定氮分析，確定蛋白質(zhì)提取率。實(shí)驗(yàn)平行3次。

蛋白質(zhì)提取率(%)=［上清液中蛋白質(zhì)含量(mg/mL)/總蛋白質(zhì)含量(mg/mL)］×100%

1.2.4 蛋白質(zhì)含量、游離氨基含量與蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定

1.2.4.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參照凱氏定氮法［14］。

1.2.4.2 氨基含量與蛋白質(zhì)水解度(DH)測(cè)定 參照OPA法［15-16］，水解度計(jì)算公式［17］如下:

式中:5.71為大豆蛋白質(zhì)的換算系數(shù);0.35mmol/g為大豆蛋白質(zhì)的游離氨基含量;7.8mmol/g為大豆蛋白質(zhì)的肽鍵含量;N1為提取物的氮含量(mg/mL)。

1.2.5 抗氧化活性分析

1.2.5.1 DPPH自由基的清除 文獻(xiàn)18并略作改動(dòng)，樣品濃度均為0.5mg/mL。

1.2.5.2 ABTS自由基清除能力 文獻(xiàn)19并略作改動(dòng)，樣品濃度均為4mg/mL。

1.2.6 排阻色譜分析 參照文獻(xiàn)20并略作修改，利用AKTA explorer蛋白質(zhì)快速層析系統(tǒng)、Superdex-25 10/300 GL(10mm×300 mm)色譜柱分析，最大壓力設(shè)定為0.15MPa，磷酸鹽緩沖溶液(pH 12)為洗脫液，流速為0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。開(kāi)機(jī)后，分別用2個(gè)柱體積的超純水和洗脫液清洗色譜柱至電導(dǎo)率穩(wěn)定。樣品蛋白質(zhì)濃度為2mg/mL;樣品過(guò)0.22μm水膜后進(jìn)樣量為0.5mL，并用緩沖液洗脫。

選用細(xì)胞色素 C、胰島素、氧化型谷胱甘肽、L-酪氨酸，作為測(cè)定提取物分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。先用緩沖溶液?jiǎn)为?dú)配制1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述條件下分析;然后再用緩沖液將4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制為1mg/mL的混合溶液，同樣在上述條件下處理、分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 采用 Excel 2003軟件和SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中毛豆腐的重要組成變化

毛豆腐發(fā)酵過(guò)程中，水分會(huì)因蒸發(fā)而丟失，蛋白質(zhì)等組成會(huì)發(fā)生變化，如表1所示。隨著毛豆腐發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，水分含量降低，總蛋白質(zhì)含量逐漸增加，并且水溶性蛋白質(zhì)有非常顯著的增加，說(shuō)明毛霉分泌的蛋白酶具有蛋白質(zhì)分解能力，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷水解大豆蛋白質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)生分子量較小的肽與氨基酸，使得水提取物中的蛋白質(zhì)含量顯著增加。

2.2 毛豆腐提取物中可溶性蛋白質(zhì)的提取率

在不同的溶劑提取條件下，不同發(fā)酵時(shí)間的毛豆腐中可溶性蛋白質(zhì)的提取率如表2所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，毛霉分泌蛋白酶的水解作用加大，蛋白質(zhì)的水解增加，導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的提取率增加。故此，不同提取溶劑下的可溶性蛋白質(zhì)的提取率均呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。

對(duì)發(fā)酵毛豆腐與未發(fā)酵毛豆腐分別采用5種溶劑進(jìn)行提取，用pH 6.5水得到的可溶性蛋白質(zhì)最多、提取率最高，而60%乙醇得到的可溶性蛋白質(zhì)最少、提取率最低。3種乙醇提取物中，可溶性蛋白質(zhì)的提取率隨乙醇濃度的增加而降低，這與提取溶劑的極性降低有關(guān)。由于pH4.5為大豆蛋白的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)溶解度低，所以，pH4.5水的可溶性蛋白質(zhì)提取率比pH6.5水的提取率更低。整體上看，第9d時(shí)，無(wú)論采用何種提取溶劑，可溶性蛋白質(zhì)的提取率最大。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間毛豆腐的一些化學(xué)指標(biāo)變化

表2 不同發(fā)酵時(shí)間毛豆腐提取物中的蛋白質(zhì)提取率(%)

表3 不同發(fā)酵時(shí)間毛豆腐提取物中的蛋白質(zhì)水解度(%)

表4 不同發(fā)酵時(shí)間毛豆腐提取物的DPPH自由基清除活性(%)

表5 不同發(fā)酵時(shí)間毛豆腐提取物的ABTS自由基清除活性(%)

2.3 毛豆腐提取物中蛋白質(zhì)的水解度

不同發(fā)酵時(shí)間，不同提取溶劑得到的毛豆腐提取物中，蛋白質(zhì)的水解度測(cè)定結(jié)果如表3所示。由于所測(cè)得的蛋白質(zhì)水解度數(shù)值范圍在17%～45%，證明所得到的提取物中蛋白質(zhì)成分是大豆蛋白的水解物。數(shù)據(jù)表明，隨著毛豆腐發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆蛋白的水解作用逐漸增加，所以產(chǎn)生更多的小肽和氨基酸，整體上提取物中蛋白質(zhì)的水解度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。pH4.5水提取毛豆腐時(shí)，由于大豆蛋白質(zhì)沉淀，提取物中含有最多的小肽和氨基酸、最少的蛋白質(zhì)，提取物的蛋白質(zhì)水解度最大。pH6.5水不僅提取小肽和氨基酸，也提取部分蛋白質(zhì)，所以提取物的蛋白質(zhì)水解度最小。由于乙醇濃度越高，提取物中蛋白質(zhì)含量越低而小肽和氨基酸越高，所以乙醇溶液提取物中蛋白質(zhì)的水解度，整體上與乙醇濃度成正比，60%乙醇溶液提取物中蛋白質(zhì)的水解度最大。

2.4 毛豆腐提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除活性

對(duì)發(fā)酵時(shí)間為3、5、7、9d的毛豆腐分別用5種提取溶劑進(jìn)行提取，然后對(duì)提取物的自由基清除活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并以大豆分離蛋白為對(duì)照進(jìn)行比較，得到表4和表5的結(jié)果。我們選用大多數(shù)研究中常用的DPPH、ABTS自由基作為評(píng)價(jià)對(duì)象。

分析結(jié)果表明，大豆分離蛋白對(duì)DPPH自由基的清除率為 3.79%，對(duì) ABTS自由基的清除率為4.97%。相比之下，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，不同溶劑提取的毛豆腐提取物對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除活性增強(qiáng)，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大豆分離蛋白。這說(shuō)明毛霉發(fā)酵有效地提高毛豆腐的抗氧化活性。整體上，毛豆腐pH 4.5水提取物對(duì)2種自由基的清除率活性變化幅度最小，低于毛豆腐pH 6.5水提取物，但大于大豆分離蛋白，而且發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)其清除活性均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，這與他人研究的腐乳前期發(fā)酵過(guò)程中自由基清除活性的變化一致［21］。尤為突出的是，毛豆腐的乙醇提取物顯示出比毛豆腐的水提取物有更高的自由基清除活性，并且60%乙醇溶液提取出的提取物的自由基清除活性最大，20%乙醇溶液提取出的提取物的自由基清除活性最小。所以，極有可能是由于乙醇溶液的非極性增加，導(dǎo)致提取物中具有更多的疏水性小肽和氨基酸，從而提高提取物的自由基清除活性。之前的研究也揭示貝類發(fā)酵物的抗氧化活性與提取物中氨基酸的疏水性有關(guān)［22］。

是否由于大豆中存在的異黃酮被乙醇溶液提取，從而對(duì)乙醇提取物的自由基清除活性評(píng)價(jià)產(chǎn)生了影響。在研究過(guò)程中，我們對(duì)乙醇溶液提取物進(jìn)行活性碳處理，利用活性碳吸附作用除去可能存在的異黃酮。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛豆腐乙醇提取物經(jīng)活性碳處理后，對(duì)2種自由基的清除率確實(shí)有所降低，但是降低幅度約為7%～9%，可能與活性炭對(duì)部分肽或氨基酸的吸附作用有關(guān)。不過(guò)可以肯定的是，異黃酮對(duì)提取物的自由基清除活性評(píng)價(jià)影響甚微。另外，其他人在對(duì)豆豉的抗氧化性研究中也發(fā)現(xiàn)，抗氧化性與可溶性成分有關(guān)，而與異黃酮關(guān)系不大［23］。所以，我們的結(jié)論與其一致。至于毛豆腐提取物中哪些肽成分具有較好的自由基清除活性，還有待于進(jìn)一步的研究。

2.5 排阻色譜分析圖譜

由于發(fā)酵9d后毛豆腐的5種提取物的自由基清除活性均最好，所以利用排阻色譜對(duì)這5種提取物進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 排阻色譜分析圖譜

在標(biāo)準(zhǔn)樣品中，細(xì)胞色素C、胰島素、氧化型谷胱甘肽、L-酪氨酸的分子質(zhì)量分別為12200、5733、612.6、181.2，相應(yīng)的洗脫體積分別為3.5、8.6、11.9、19.2mL。從圖1B、圖1C中可以看出，5種提取物主要組成成分的洗脫體積范圍大致在9.8～21.2mL之間。因此，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣的洗脫體積，初步斷定5種提取物中大分子質(zhì)量物質(zhì)為分子質(zhì)量小于5733的肽類，而小分子質(zhì)量的物質(zhì)則為游離氨基酸，表明毛豆腐發(fā)酵過(guò)程中一些大豆蛋白充分降解，產(chǎn)生了肽和游離氨基酸。從圖1B、圖1C的譜圖還可以看出，不同溶劑得到的提取物，其組成還是有一定差別的，例如，pH6.5水提取物中，與pH4.5水提取物相比，就含有更多的大分子質(zhì)量肽，而3種乙醇液提取物的組成也是有區(qū)別的。乙醇的含量越低，提取物中大分子質(zhì)量的肽也就相對(duì)多一些。這些組成的差異，可能是導(dǎo)致其自由基清除活性不同的原因。

3 結(jié)論

3.1 在0～9d的發(fā)酵過(guò)程中，毛豆腐的水分含量逐漸降低，蛋白質(zhì)含量逐漸增加，同時(shí)水溶性蛋白質(zhì)含量也有顯著增加。

3.2 利用5種提取劑:20%、40%、60%(v/v)乙醇溶液，pH4.5水，pH6.5水;分別對(duì)發(fā)酵時(shí)間不同的毛豆腐進(jìn)行提取，所得到的各種提取物中，可溶性蛋白質(zhì)的提取率隨毛豆腐發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而增加，最高可達(dá)到33.9%;pH6.5水提取物可溶性蛋白質(zhì)提取率高于pH4.5水提取物;隨著提取溶劑中乙醇濃度的增加，乙醇溶劑提取物中可溶性蛋白質(zhì)的提取率下降。

3.3 各種提取物中蛋白質(zhì)的水解度在17%～45%，并隨毛豆腐發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，說(shuō)明提取物蛋白質(zhì)成分為大豆蛋白質(zhì)的水解物。pH4.5水提取物中蛋白質(zhì)的水解度，大于pH6.5水提取物中蛋白質(zhì)的水解度;并且，隨著提取溶劑中乙醇濃度的增加，提取物中蛋白質(zhì)的水解度也增加。

3.4 隨著毛豆腐發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，提取物對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除活性也增加，大小順序?yàn)?60%乙醇溶液提取物＞40%乙醇溶液提取物＞20%乙醇溶液提取物＞pH6.5水提取物＞pH4.5水提取物。結(jié)果顯示，提取溶劑對(duì)提取物的自由基清除活性具有影響作用，但有待于進(jìn)一步的分析研究。

3.5 排阻色譜分析結(jié)果表明，發(fā)酵9d后，毛豆腐的各種提取物的主要組成為肽與氨基酸，不同提取物的組成有區(qū)別，可能是其自由基清除活性不同的重要原因。

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Study on the free radical scavenging activity of the extracts from mao-tofu in vitro

HANG Mei，ZHAO Xin-huai*
(Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Mao-tofu fermented for 3，5，7，9 days were extracted by five extraction solvents，including 20%，40%， 60%ethanol solution(v/v)，pH 4.5 and pH 6.5 water，respectively.The extracting yield of the proteins and the degree of hydrolysis of the proteins in the extracts were analyzed.The free radical scavenging activities of the extracts on DPPH，ABTS radicals were evaluated.The results showed that the longer the fermentation time was，the higher the extracting yield and the degree of hydrolysis of the proteins in the extracts were，and the higher the free radical scavenging activity of the extract was.It was also found that the free radical scavenging activities of ethanol extracts of mao-tofu were higher than water extracts，and the free radical scavenging activity of ethanol extracts increased with the concentration of ethanol applied in extraction.The analysis results from size exclusion chromatography confirmed that the five extracts obtained from mao-tofu fermented for 9 days were mainly peptides and amino acids，indicating the occurrence of hydrolysis of soybean proteins.

mao-tofu;extracts;extracting yield;degree ofhydrolysis;radical scavenging activity;size exclusion chromatography

TS214.2

A

1002-0306(2011)09-0169-05

大豆在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生多種抗氧化成分，例如多肽類。許多研究證明，大豆發(fā)酵制品比沒(méi)發(fā)酵之前顯示出更強(qiáng)的抗氧化活性［1］。Yang等的研究表明，發(fā)酵后的大豆顯示出更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力［2］。Easki等報(bào)道，日本豆醬、納豆和天貝在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了抗氧化成分［3］。毛豆腐是我國(guó)徽州的著名小吃，在我國(guó)有較大的消費(fèi)人群［4］，它是利用豆腐通過(guò)微生物發(fā)酵所制成的一種干酪型產(chǎn)品，可以有效地提高大豆的消化率和生物價(jià)［5］。毛霉是生產(chǎn)毛豆腐的主要菌種，這主要是因?yàn)槊鼓芊置诘鞍酌福瑢⒌鞍踪|(zhì)分解生成氨基酸和多肽等，使食品具有獨(dú)特的風(fēng)味和細(xì)膩的質(zhì)地，受到消費(fèi)者的喜愛(ài)。以往對(duì)毛豆腐的研究主要偏重于發(fā)酵過(guò)程中的化學(xué)成分、微細(xì)結(jié)構(gòu)和組織形態(tài)的變化［6］，而對(duì)毛豆腐中蛋白質(zhì)的生物活性的研究甚少。過(guò)去的研究工作表明，大豆蛋白肽具有抗氧化［7］、降膽固醇［8］、降血壓［9-10］、提高免疫力［11］、抗癌［12］等生物功能。因此，研究毛豆腐中肽類的抗氧化性質(zhì)很有必要。本研究采用5種不同溶劑提取發(fā)酵后的毛豆腐樣品，分析各種提取物中蛋白質(zhì)的含量及水解程度，并評(píng)價(jià)各提取物對(duì)兩種自由基的體外清除活性，確定發(fā)酵時(shí)間和溶劑種類對(duì)毛豆腐提取物抗氧化能力的影響;然后利用排阻色譜初步評(píng)價(jià)了提取物的組成情況。

2010-08-31 *通訊聯(lián)系人

杭梅(1984-)，女，在讀碩士研究生，研究方向:食品科學(xué)。