高效液相色譜法測(cè)定羅非魚(yú)肌肉中硝基咪唑類(lèi)多組分殘留量

王 揚(yáng)，鄭重鶯，何 豐，葉磊海

(浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心，浙江 杭州 310012)

高效液相色譜法測(cè)定羅非魚(yú)肌肉中硝基咪唑類(lèi)多組分殘留量

王 揚(yáng)，鄭重鶯，何 豐，葉磊海

(浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心，浙江 杭州 310012)

建立一種同時(shí)測(cè)定羅非魚(yú)肌肉中甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑5種硝基咪唑類(lèi)藥物殘留量的反相高效液相色譜法。水產(chǎn)品肌肉組織經(jīng)勻漿，加氯化鈉、磷酸氫二鉀和乙酸乙酯振蕩提取，取有機(jī)相濃縮，殘余物加鹽酸和乙酸乙酯溶解，正己烷去脂后過(guò)MCX柱，2%濃氨水甲醇溶液洗脫，色譜柱分離，以醋酸氨緩沖液-乙腈(86:14，V/V)為流動(dòng)相，320nm紫外檢測(cè)。結(jié)果顯示：測(cè)定肌肉組織中5種硝基咪唑類(lèi)藥物的最低檢測(cè)限均為1.0μg/kg。在2.0μg/kg的加樣水平下，甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑及洛硝噠唑在羅非魚(yú)中的回收率分別為73.3%%、74.7%、62.9%、74.4%、80.1%；測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10%。本方法簡(jiǎn)便、靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度均符合我國(guó)農(nóng)業(yè)部獸藥殘留分析方法的要求。

固相萃取；高效液相色譜法；羅非魚(yú)；硝基咪唑

硝基咪唑類(lèi)藥物(nitroimidazoles)屬于硝基雜環(huán)化合物，主要有甲硝唑、二甲硝咪唑、替硝唑、奧硝唑、洛硝達(dá)唑、地美硝唑等。硝基咪唑類(lèi)藥物的抗原蟲(chóng)活性和抗厭氧菌活性受到人們的廣泛重視。體內(nèi)外毒理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，硝基咪唑類(lèi)藥物對(duì)某些動(dòng)物具有致癌、致突變、損傷DNA等作用[1]，對(duì)人體具有潛在致癌性。歐盟已于1993年規(guī)定禁止食品動(dòng)物使用洛硝噠唑，現(xiàn)己全面禁止使用該藥，且規(guī)定可食性動(dòng)物組織中硝基咪唑類(lèi)藥物不得檢出[2-3]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定“禁止甲硝唑、地美硝唑作為飼料添加劑用于食品動(dòng)物，禁止洛硝達(dá)唑用于所有食品動(dòng)物的任何用途”[4]。

目前，國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，研究在禽肉、蜂蜜等動(dòng)物源性食品中硝基咪唑的測(cè)定方法主要有免疫法[5]、氣相色譜法[2,6]、高效液相色譜法[7-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-12]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]，但免疫法的檢測(cè)項(xiàng)目有限，氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mess spectrometry，GC-MS)法需要進(jìn)行衍生，GC法的靈敏度不過(guò)高。我國(guó)現(xiàn)有的水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中缺少硝基咪唑類(lèi)藥物殘留的測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)，尚未見(jiàn)在水產(chǎn)品中同時(shí)檢測(cè)5種硝基咪唑類(lèi)藥物的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以固相萃取法為凈化手段，采用液相色譜-紫外檢測(cè)技術(shù)，建立測(cè)定羅非魚(yú)肌肉中硝基咪唑類(lèi)多組分殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑標(biāo)準(zhǔn)品(純度均為99.0%) 美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲醇(均為色譜純) 美國(guó)天地公司；其他試劑無(wú)特別說(shuō)明均為分析純；水為超純水。

1100高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司；組織勻漿機(jī) 江蘇國(guó)華公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；恒溫振蕩器 金壇市富華儀器有限公司；DK-S24型恒溫水浴鍋 上海森信儀器公司；氮吹儀 美國(guó)Organomation公司；Oasis MCX固相萃取柱(3CC) 美國(guó)Waters公司；純水過(guò)濾裝置 法國(guó)Millipore公司。1.2 方法

1.2.1 醋酸緩沖液的配制

稱取0.82g無(wú)水醋酸鈉溶解于800mL水中，以冰醋酸調(diào)節(jié)pH4.3，加水定容至1000mL。

1.2.2 濃氨水甲醇溶液的配制

準(zhǔn)確移取2mL濃氨水，用甲醇定容到100mL。1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑標(biāo)準(zhǔn)品各10.0mg，混合后用甲醇溶解并定容到100mL，質(zhì)量濃度為100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液(冷藏保存，可保存6個(gè)月)；標(biāo)準(zhǔn)工作液：臨用時(shí)準(zhǔn)確移取貯備液，用流動(dòng)相稀釋，配制成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。1.2.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10.00g肌肉，放到組織搗碎機(jī)中，加入2.0g氯化鈉和2.0g磷酸氫二鉀，均質(zhì)，加入20.0mL乙酸乙酯，40℃振蕩提取60.0min，過(guò)濾，用20.0mL乙酸乙酯重復(fù)提取，合并濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干。

用1mL 1.0moL/L鹽酸和1.5mL乙酸乙酯洗滌旋發(fā)瓶，轉(zhuǎn)移到20.0mL的分液漏斗，重復(fù)用1mL 1.0moL/L鹽酸和1.0mL乙酸乙酯洗滌，一起轉(zhuǎn)移到分液漏斗，加入5.0mL正己烷，振蕩，靜置30min，收集下層。樣品過(guò)MCX柱(預(yù)先用2.0mL甲醇、2.0mL水沖洗)，讓樣品在自然重力下流出，吹干，加3.0mL水洗柱，加3.0mL體積分?jǐn)?shù)2%的濃氨水-甲醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，水浴40℃以氮?dú)獯抵?.5mL，用流動(dòng)相定容至1.0mL，經(jīng)過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾后，供液相色譜測(cè)定。

1.2.5 色譜條件

色譜柱為HC C18柱(250×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為醋酸緩沖液-乙腈(86:14，V/V)，使用前以0.45μm濾膜過(guò)濾，并超聲脫氣；流速1.0mL/min；色譜柱溫30℃；進(jìn)樣量30μL；檢測(cè)波長(zhǎng)320nm。當(dāng)樣品圖譜和標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時(shí)間一致時(shí)，采用DAD對(duì)該色譜峰進(jìn)行紫外光譜特征掃描，作為定性的依據(jù)，以避免假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的選擇

由于硝基咪唑類(lèi)藥物具有兩性性質(zhì)，即在弱堿性條件下呈游離分子狀態(tài)，在弱酸性條件下質(zhì)子化，因此加入磷酸氫二鉀使溶液呈弱堿性，以便于加硝基咪唑類(lèi)物質(zhì)完全從樣品中提取出來(lái)[7,11]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中多使用二氯甲烷、乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑[8-10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了該3種提取液的提取效果，發(fā)現(xiàn)針對(duì)提取樣品中甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑5種成分的回收率，乙酸乙酯依次高于乙腈和二氯甲烷，二氯甲烷、乙腈提取液中雜質(zhì)含量明顯高于乙酸乙酯，乙腈去蛋白效果好，但乙腈與水互溶，進(jìn)一步萃取時(shí)乳化現(xiàn)象較嚴(yán)重，且乙腈沸點(diǎn)較高，提取后不容易蒸干濃縮。采用乙酸乙酯提取動(dòng)物肌肉組織中的硝基咪唑類(lèi)藥物，在提取液中加磷酸氫二鉀，使溶液呈弱堿性，加入氯化鈉，其鹽析作用可以提高回收率。2.2 凈化條件的選擇

萃取樣品的乙酸乙酯液中含有較低極性的雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪等脂溶性物質(zhì)，液-液萃取時(shí)容易乳化，因此考慮采用固相萃取法凈化樣品。因此選用HLB、C18、MCX三種不同填料的萃取小柱，比較回收率和峰型圖(圖1)可以看出。使用MCX柱時(shí)不僅峰形好而且5種硝基咪唑類(lèi)藥物的回收率均較高。

圖1 使用MCX柱凈化羅非魚(yú)樣品中添加硝基咪唑類(lèi)藥物色譜圖Fig.1 Chromatogram of nitroimidazoles in tilapia muscle samples using MCX SPE

離子交換固定相上組分的保留和洗脫主要決定于流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度、反離子強(qiáng)度和pH值，與溶劑強(qiáng)度關(guān)系較小[1]。國(guó)內(nèi)外報(bào)道中，分析硝基咪唑類(lèi)藥物使用了很多類(lèi)型填料的固相萃取柱[7,11]。硝基咪唑類(lèi)藥物為弱堿性藥物，可在陽(yáng)離子交換柱上有效保留，所以本實(shí)驗(yàn)選擇強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂固相萃取柱(MCX柱)凈化。

在羅非魚(yú)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品2.0μg/kg時(shí)，采用乙腈、甲醇、體積分?jǐn)?shù)2%的濃氨水甲醇3種不同的洗脫液計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，2%濃氨水-甲醇溶液做洗脫液時(shí)，甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑的回收率均比乙腈和甲醇高，分別為73.3%、74.7%、62.9%、74.4%、80.1%。所以確定洗脫液為2%濃氨水-甲醇溶液。

通過(guò)不同體積洗脫液比較硝基咪唑類(lèi)藥物的回收率。洗脫液體積為3～5mL時(shí)，硝基咪唑類(lèi)藥物的回收率相差不多，考慮到后續(xù)的氮吹過(guò)程中洗脫液體積較少較節(jié)約時(shí)間，故確定洗脫液的體積為3mL。

2.3 色譜條件的選擇

高效液相色譜法檢測(cè)微量藥物的分離條件不僅要求盡量將組分分開(kāi)，而且還要求色譜峰與雜質(zhì)峰盡量分開(kāi)。國(guó)內(nèi)外檢測(cè)硝基咪唑的流動(dòng)相多采乙腈-水或甲醇-水。本實(shí)驗(yàn)嘗試甲醇-水、乙腈-水等流動(dòng)相體系，但峰型不理想，因此選用醋酸氨緩沖液:乙腈比例為86:14 (V/V)，此時(shí)雜質(zhì)峰和溶劑峰在組分出峰時(shí)間之前均已出峰，因此這個(gè)流動(dòng)相比例是較為合理的。

5種組分的紫外最大吸收波長(zhǎng)略有差異，考慮到色譜峰中雜質(zhì)干擾問(wèn)題，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)越大雜質(zhì)干擾越少，經(jīng)過(guò)全波長(zhǎng)掃描確定紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm。

2.4 線性、重現(xiàn)性、檢出限和回收率

配制硝基咪唑類(lèi)混標(biāo)的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液分別為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0μg/mL，每一質(zhì)量濃度重復(fù)3次，按上述液相色譜條件分析，測(cè)出對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，樣品濃度在15.0～750.0μg/kg范圍內(nèi)，各組分含量(X)和峰面積(Y)有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)工作曲線的相關(guān)系數(shù)均能達(dá)到0.99以上。

將標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度較低的一組溶液，對(duì)每個(gè)質(zhì)量濃度樣品測(cè)定3次，記錄并計(jì)算每次測(cè)得的信號(hào)強(qiáng)度與背景信號(hào)強(qiáng)度的均值，以能達(dá)到RSN≥3時(shí)的樣品質(zhì)量濃度為標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的最低檢測(cè)限，以能達(dá)到RSN≥10時(shí)樣品的質(zhì)量濃度為標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的最低定量限。對(duì)羅非魚(yú)空白樣品中以1.0μg/kg加標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各色譜峰明顯，計(jì)算RSN在11.6～34.3之間。因此把此質(zhì)量濃度作為最小檢出質(zhì)量濃度。

在10.0g羅非魚(yú)空白樣品中加入適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備陽(yáng)性樣品。按1.2.4節(jié)方法提取凈化后液相色譜檢測(cè)。1d內(nèi)每一水平重復(fù)3個(gè)樣品，取平均值，計(jì)算日內(nèi)平均回收率及標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 羅非魚(yú)中添加不同水平硝基咪唑類(lèi)藥物的回收率(n=3)Table 1 Recoveries of 5 nitroimidazoles from tilapia muscle at different spike levels (n = 3)

3 結(jié) 論

采用固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定羅非魚(yú)肌肉中甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑5種殘留量，方法檢出限均以達(dá)到1.0μg/kg。該方法操作方便、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度均可以滿足水產(chǎn)品中硝基咪唑類(lèi)殘留檢測(cè)分析的需要。

[1]朱蓓蕾. 動(dòng)物性食品藥物殘留[M]. 上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 1994: 56.

[2]WANG J H. Determination of three nitroimidazole residues in poultry meat by chromatography with nitrogen-phosphorus detection[J]. Journal of Chromatography A, 2001, 9(8): 435-438.

[3]SEMENIUK S, POSYNIAK A, NIEDIELSKA J. Determination of nitroimidazole residues in poultry tissues, serum and eggs by highperformance liquid chromatography[J]. Biomed Chromatogr, 1995, 9 (5): 238-242.

[4]張雨梅, 謝愷舟, 曹永忠, 等. 二甲硝咪唑及其代謝物在豬體內(nèi)的消除規(guī)律[J]. 中國(guó)獸藥學(xué)報(bào), 2001, 21(3): 293-295.

[5]STANKER L H, MCKEON C, WATKINS B E, et al. Detection of dimetridazole and other nitroimidazole residues in turkey using an immunoassy[J]. Journal Agriculture and Food Chemistry, 1993, 41(5): 1332-1336.

[6]劉波, 黃為紅, 王金中. 氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)硝基咪唑類(lèi)藥物[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 24(5): 586-588.

[7]沈建忠, 項(xiàng)新華, 張躍, 等. 家禽肌肉組織中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留高效液相色譜檢測(cè)法研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 36(6): 700-703.

[8]王建華. 液相色譜紫外法測(cè)定雞肉中三種硝基咪唑殘留量[J]. 化學(xué)分析計(jì)量, 2000, 9(4): 9-10.

[9]ANTHONY H F, READER J A. Determination of dimetronidazole residues in poultry tissues by high-performance liquid chromatography [J]. Chromatography Analys, 1983, 108(10): 1091-1095.

[10]張璐, 孔祥虹, 何強(qiáng), 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)奶粉中3種硝基咪唑殘留物的測(cè)定[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2010, 29(3): 306-309.

[11]楊成對(duì), 宋利輝. 家禽肌肉組織中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2006, 25(4): 101-103.

[12]王海, 劉素英, 單吉浩, 等. 高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定豬組織中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留量[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2005, 39(12): 8-11.

[13]汪紀(jì)倉(cāng), 馬素英, 王大菊, 等. 氣相色譜-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定豬肉中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2008, 39(12): 1772-1778.

Simultaneous Determination of Nitroimidazoles Multi-residues in Tilapia Muscle by High Performance Liquid Chromatography

WANG Yang，ZHENG Chong-ying，HE Feng，YE Lei-hai
(Aquatic Product Quality Testing Center of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China)

A high-performance liquid chromatography (HPLC) method was developed for the simultaneous analysis of 5 nitroimidazole multi-residues (metronidazole, dimetridazole, ornidazole, tinidazole and ronidazole) in tilapia muscle tissues. Samples were homogenized and extracted by added sodium chloride, monopotassium phosphate and ethyl acetate. Afterwards, the organic phase was recovered and condensed. Finally, the residue was dissolved in hydrochloric acid/ethyl acetate, defatted by liquid-liquid extraction with addedn-hexane, cleaned up on an MCX column by elution with 2% ammonia/methanol, separated chromatographically using acetate buffer solution/acetonitrile (86:14,V/V) as the mobile phase and detected at 320 nm. The results revealed that the limits of detection for 5 nitroimidazoles were all 1.0 μg/kg. The average recoveries for metronidazole, dimetridazole, ornidazole, tinidazole and ronidazole at the spike level of 2.0 μg/kg were 73.3%%, 74.7%, 62.9%, 74.4% and 80.1%, respectively with a RSD of less than 10% (n= 3). This method is simple, sensitive, accurate, precise, and in line with the requirements the Ministry of Agriculture for veterinary drug residue analysis.

solid phase extraction；high performance liquid chromatography (HPLC)；tilapia；nitroimidazoles

TS207.3；O657

A

1002-6630(2011)20-0197-03

2011-02-28

浙江省科技廳水產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)課題(2011R09031-10)

王揚(yáng)(1973—)，女，高級(jí)工程師，碩士，主要從事水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量檢測(cè)和安全評(píng)價(jià)研究。E-mail：wangyangruanfeng@163.com