頂空固相微萃取-氣質聯用快速測定大曲中的揮發性風味成分

張春林，敖宗華，炊偉強，沈才洪，陶文沂,*，張宿義

(1.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000)

頂空固相微萃取-氣質聯用快速測定大曲中的揮發性風味成分

張春林1，敖宗華2，炊偉強1，沈才洪2，陶文沂1,*，張宿義2

(1.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000)

為探討大曲中的揮發性風味成分，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法(HS-SPME-GC-MS)分析瀘州老窖中高溫大曲的揮發性成分，考察萃取頭、萃取時間、萃取溫度對大曲樣品中揮發性風味物質萃取的影響。結果表明：采用50/30μm碳分子篩/聚二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR on PDMS)纖維頭在50℃條件下對大曲樣品頂空吸附30min，萃取效果最好；大曲樣品的分析表明，其揮發性風味物質中含量較高的是醇類、酯類和酮類化合物，另外還含有一些吡嗪類化合物。該方法對大曲中常見揮發性風味成分的測定有良好的重復性和回收率，方便快速。

頂空固相微萃取法；氣相色譜-質譜聯用；瀘州老窖大曲；揮發性風味化合物

大曲是以單一小麥或小麥、大麥和豌豆混合物為原料，經粗粉碎后加水壓成磚狀曲坯，人工控制在一定的溫度、濕度條件下培育而成的粗酶制劑[1]。它是釀酒發酵的動力，用于蒸餾酒的釀造。目前許多名優白酒就是利用大曲作為釀酒的原料。大曲微生物區系以霉菌占大多數，酵母菌和細菌比較少[2]。在大曲制造過程中微生物的代謝產物和原料的分解產物直接或間接地構成了白酒的風味物質，使白酒具有各種不同的獨特的風味[3]。因此，大曲還是生香劑。不少專家認為，大曲中富含大量香味前驅物質，因此，大曲本身就是一種香味物質的富集物，所謂的曲香正是一種表現[4]。然而目前對于大曲中的香味物質研究較少。

分析樣品中的香味物質，通常要對香氣成分進行濃縮預處理。傳統的濃縮預處理方法有液-液萃取法、頂空法、吹掃捕集法、同時蒸餾萃取法和固相萃取法[5]。這些方法都不同程度地存在某些缺點，或費用太高，或樣品量過多、耗時過長，或使用的是對人體有害的昂貴的有機溶劑，對操作者造成潛在的危害，還可能在濃縮過程中丟失揮發性物質。與傳統的風味物質抽提技術相比，固相微萃取(SPME)簡便、快速、經濟安全、無溶劑、選擇性好且靈敏度高，可直接與氣相色譜-質譜、高效液相色譜、毛細管電泳儀等聯用，集采樣、萃取、進樣于一體，大大加快了分析檢測的速度[6-7]，近年來該技術在食品風味分析中應用越來越廣泛[8-12]。

本研究采用HS-SPME與氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用的方法，優化頂空固相微萃取法參數，探討HS-SPME用于分離大曲中香氣物質的可行性，對大曲樣品的香氣物質進行定性定量測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大曲樣品及其前處理：瀘州老窖中高溫大曲優級曲；將采集的到的整塊大曲粉碎后并全部過40目篩，混合均勻后，取0.5g大曲樣品放入頂空瓶中再加入飽和NaCl溶液5mL蓋上瓶蓋。

Trace MS氣相色譜-質譜聯用儀 美國Finnigan公司；DB-WAX彈性石英毛細管柱(30m×0.25mm，0.25 μm)、萃取裝置：SPME手動進樣手柄、萃取頭(85μm PA、100μm PDMS、75μm CAR/PDMS、50/30μm DVB/CAR on PDMS) 美國Supelco公司；Turbo Matrix TD熱脫附進樣器 美國Perkin Elmer公司。頂空進樣瓶(15mL)中國安譜公司；RCT-Basic加熱磁力攪拌器 日本島津公司。

1.2 頂空固相微萃取條件

萃取頭的老化：第一次使用時50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取頭在氣相色譜進樣口270℃老化1h，75μm CAR/PDMS萃取頭在氣相色譜進樣口300℃老化1h，85 μm PA萃取頭在氣相色譜進樣口280℃老化1h，100μm PDMS萃取頭在氣相色譜進樣口250℃老化0.5h。

萃取條件：50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取纖維頭，于50℃插入加入飽和 NaCl 5mL的大曲樣品(0.5g)頂空吸附30min，于250℃解吸5min后進行GC-MS分離鑒定。

1.3 氣相色譜-質譜分析條件

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)； 載氣為He，流速1mL /min； 程序升溫：起始溫度40℃，保持3min，以5℃/min 升溫速率升至80℃，最后以10℃/min升至230℃/min 保持7min；汽化室溫度250℃；不分流。

質譜條件：電子轟擊電離(E I)離子源，電子能70eV，發射電流200μA，電子倍增器電壓350V，離子源溫度200℃， 接口溫度250℃，質量范圍33～450u。

1.4 定性與定量分析

定性：實驗數據處理由Xcalibur軟件完成，未知化合物經計算機檢索的同時與NIST譜庫(107000個化合物的數據)和Wiley譜庫(320000個化合物的數據)相匹配，只有當正反匹配度均大于800(最大值為1000)的鑒定結果才予以確認。

定量：選擇2-辛醇為內標(終質量濃度10ng/mL)，大曲樣品中鑒定的化合物質以與2-辛醇質量濃度之比計算。

2 結果與分析

2.1 固相微萃取纖維頭的篩選

選用4種萃取頭在相同的吸附條件(50℃吸附30min)和解吸條件(250℃解吸5min)下進行實驗。從表1來看，50/30μm DVB/CAR on PDMS的總的峰面積為5.5×108，幾乎是85μm PA總峰面積的7.6倍，100μm PDMS的12.0倍和75 μ m CAR /PDMS的1.9倍，說明50/30μ m DVB/CAR on PDMS的吸附能力比其他的萃取頭強，這和文獻[13]報道一致。從檢出的有效化合物的個數來看，50/30μm DVB/CAR/PDMS檢出了55種化合物，而75μm CAR/PDMS檢出了47種化合物，比單一組分涂層的85 μm PA(35種化合物) 和100μm PDMS(38種化合物)要多。這主要是因為萃取頭涂層的極性不同的緣故[14]。萃取頭對所分析的化合物有選擇性，對大曲樣品而言，50/30 μm DVB/CAR on PDMS 復合涂層的萃取頭更加適合，不僅分離出的化合物比較全面，而且風味強度也很大，色譜分析響應值較高，因而選擇作為實驗用萃取頭[10,15]。

表1 不同萃取頭的萃取效果Table 1 Effect of fiber type on volatile extraction

2.2 萃取時間的選擇

選用50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取頭，萃取溫度為50℃的條件下，比較5個不同吸附時間對吸附效果的影響。由圖1可知，萃取時間延長，萃取物總峰面積增加。吸附時間從10min增加到30min時峰面積增加較明顯；當吸附時間繼續延長到50min時，總峰面積變化幅度不大，趨于平衡，可能此時存在吸附-解吸附平衡。因此選擇吸附時間為30min，此時間正好與GCMS分析樣品所需的時間比較接近，從而提高了單位時間內樣品分析的效率。

圖1 萃取時間對萃取效果的影響Fig.1 Effect of time on volatile extraction

2.3 萃取溫度的選擇

萃取溫度對萃取效果的影響具有兩面性：一方面，溫度升高有利于吸附，尤其對頂空固相微萃取；另一方面，溫度升高又會增加萃取頭固有組分的解吸，從而降低萃取頭對被分析組分的吸附能力。選用50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取頭，萃取時間為30min的條件下，由圖2可明顯看到，吸附溫度升高時吸附量有所增加，但是，萃取溫度由50℃提高到60℃時總峰面積增加幅度不大，而檢出的有效化合物數目在減少，所以選擇50℃作為吸附溫度，此時檢出的化合物最多，所吸附的樣品量足夠用于GC-MS分析。

圖2 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.2 Effect of temperature on volatile extraction

2.4 萃取方法的有效性驗證

采用上述優化的分析操作條件，重復3次實驗，考察頂空固相微萃取法在分析大曲樣品中揮發性風味物質時的重復性和回收率。結果見表2，經計算，組分峰面積的相對標準偏差(RSD)最大為39.4%，最小為1.9%，平均相對標準偏差為10.9%，說明將頂空固相微萃取技術用于大曲風味物質的分析重復性良好。

表2 大曲樣品中鑒定的揮發性風味成分和含量(n=3)Table 2 Identified volatiles and their contents in Daqu sample(n= 3)

在大曲樣品中加入幾種具有代表性的揮發性風味成分，與不加入的大曲樣品同時測定，按照加標回收率的方法計算，結果見表3。大曲樣品中幾種具有代表性的風味組分回收率范圍在87.5%～114.0%，幾種代表性化合物的回收率都較高，說明該法具有很好可靠性和準確性。

表3 大曲樣品中部分揮發性風味成分的回收率Table 3 Recoveries of several of identified volatiles from spiked Daqu sample

2.5 大曲樣品中揮發性風味成分的分析

圖3 大曲中揮發性成分的總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion chromatograms of volatiles in Daqu sample

從表2分析結果來看，大曲的揮發性風味物質主要為醇類(28.6%)、酯類(16.0%)、酮類(8.9%)、醛類(7.1%)，另外吡嗪類(17.9%)在大曲中占有很高的含量。從單個化合物的含量上看，含量最高的化合物是2-戊醇，其次是苯乙醇，其他的重要微量揮發性化合物依次是乙酸乙酯、四甲基吡嗪、己醛、十六酸甲酯、3-甲基丁醇、正已醇、三甲基吡嗪、亞油酸甲酯、丁酸甲酯等。醇類可以產生使人愉快的氣味，3-甲基丁醇、苯乙醇本身還具有花草和水果的香氣；酯類物質一般都具有水果香，乙酸乙酯在大曲中含量較高，可能對曲香形成有有較大貢獻；吡嗪類物質一般都具有烘焙和堅果香，可能與大曲發酵過程中頂溫會超過50℃，由美拉德反應產生；分析對曲香形成有較大貢獻的風味物質，還需要利用GC-O法進一步研究[16-17]。范文來等[15]曾研究過醬香型白酒生產大曲，由于大曲生產工藝的明顯不同，特別是生產工藝的溫度和時間不同，濃香型白酒大曲中檢測到的揮發性成分要顯著少于醬香型白酒大曲。圖3為瀘州老窖中高溫大曲在最佳條件下使用HSSPME檢測到的微量揮發性成分的GC-MS圖。

3 結 論

本實驗建立了一種快速、簡單、樣品用量少的測定大曲樣品中揮發性成分的頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法，用該法能較好地萃取大曲樣品中的醇類、酯類、醛類、酮類、吡嗪等揮發性風味成分。對其中醇類、酯類和吡嗪類等具有代表性的揮發性成分測定的重復性良好，加標回收率也較高。說明該法可較準確地用于大曲樣品中揮發性風味成分的定量分析。為研究大曲風味，提高其質量提供了科學依據，并為濃香型白酒香味成分的來源提供參考依據。

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Rapid Analysis of Volatile Compounds in Daqu by Headspace Solid-phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ZHANG Chun-lin1，AO Zong-hua2，CHUI Wei-qiang1，SHEN Cai-hong2，TAO Wen-yi1,*，ZHANG Su-yi2
(1. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. Luzhou Laojiao Co. Ltd., Luzhou 646000, China)

In order to analyze the composition of volatile compounds in the Luzhou Laojiao Daqu by headspace solid phase micro-extraction coupled with gas chromatography mass spectrometry detection (HS-SPME-GC-MS), the effects of SPME fiber type, adsorption time, and extraction temperature on volatile extraction were investigated. Using a 50/30 μm DVB/CAR on PDMS fiber for 30 min headspace adsorption at 50 ℃ provided optimum extraction for the Daqu. Then the fiber was introduced into the injection port of the GC-MS system (at 250 ℃ for 5 min). Fifty-five compounds were isolated and identified,among which alcohols, esters, and ketones were the prominent ones. In addition, some pyrazines were also found. In conclusion,the method is simple, fast and accurate with high reproducibility and sensitivity.

headspace solid-phase microextraction (HS-SPME)；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)；Luzhou Laojiao Daqu；volatiles

TS261.2

A

1002-6630(2011)10-0137-04

2010-06-20

四川省科技支撐計劃項目(2010SZ0032)；釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室2008年度開放課題(NJ2009-01)

張春林(1982—)，男，博士研究生，主要從事發酵工程、風味化學研究。E-mail：zcl818075@163.com

*通信作者：陶文沂(1946—)，男，教授，博士，主要從事發酵工程研究。E-mail：wytao1946@163.com